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芸薹生链格孢(Alternaria brassicae)是一种在自然界中分布十分广泛的真菌,其寄主范围广,对环境适应性强,既是重要植物病原菌又是常见的腐生菌,由其引起的十字花科黑斑病常造成严重的经济损失。研究发现其高渗透压甘油信号转导途径在孢子生长、渗透胁迫、抗药性和致病性等方面起着重要的调控作用。本研究拟进一步深入研究该信号途径激酶MAPK(AbHog1)和MAPKK(AbPbs2)之间的锚定反应机制,明确二者身上存在的锚定作用位点,全面认识芸薹生链格孢高渗透压甘油信号转导途径的作用机理,深入了解该菌致病性的分子作用机理,为未来开发以该途径为靶标的新型杀菌剂提供重要的理论和技术支持。本文主要结果如下:(1)利用已知芸薹生链格孢Pbs2基因序列以及生物信息学软件分析后设计其特异性引物,通过PCR的方法扩增获得AbPbs2基因编码区DNA。经过Blast比对证实与GenBank中已有的基因同源性达到97.98%。分析其蛋白质序列后证实了成功获得AbPbs2基因。真菌HOG途径的研究不断深入,了解其代谢途径的各种相关因子的作用机理及代谢机制,能够为人类充分认识与利用微生物资源奠定理论基础。芸薹生链格孢(A.brassicicola)AbPbs2基因的克隆及功能鉴定,为进一步研究真菌生长、致病性、环境适应性等方面奠定了重要基础。(2)通过原生质体转化体系构建了AbPbs2的基因插入突变体,对比了△AbPbs2和野生菌在生长速度、产孢能力、渗透压敏感性、杀菌剂咯菌腈抗性和致病性方面的差异。结果显示菌丝生长变化不大、但产孢能力受到严重损伤,且对渗透压的敏感性增强,此外病原菌致病性也较大程度丧失。这些结果表明AbPbs2基因参与病原菌产孢、渗透压调节和致病性调控。(3)采用重叠延伸PCR的方法,扩增得到了D位点缺失的AbPbs2△D,通过原生质体转化体系成功构建了△AbPbs2/AbPbs2互补体和△AbPbs2/AbPbs2△D互补体,并将两者在生长速度、产孢能力、渗透压敏感性、杀菌剂咯菌腈抗性和致病性方面进行比对,结果显示D位点缺失的AbPbs2互补△AbPbs2突变体后,互补体的功能均没有恢复到野生菌的性状,故推测D位点在AbPbs2与AbHog1的锚定作用中起着重要作用。