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目的：
运用RNAi技术,将构建的ERRγshRNA表达质粒转入Ishikawa细胞,探讨ERRγ沉默后对子宫内膜癌生物学特性及雌激素处理前后ERK的活化情况,初步阐明ERRγ在子宫内膜癌发病机制中的作用以及与子宫内膜癌发生与发展的关系。
方法：
构建含有ERRγshRNA的表达载体,用含有ERRγshRNA的表达载体转染Ishikawa细胞,用RT-PCR方法观察转染前后子宫内膜癌Ishikawa细胞中ERRγMrna的表达情况;应用免疫荧光、流式细胞技术及Westernblot方法分析下调子宫内膜癌Ishikawa细胞中ERRγ的对雌激素促增殖作用的影响。
结果：
1、RT-PCR分析了Ishikawa细胞中ERRγ表达情况,结果表明仅有ERRγ2表达。
2、构建针对ERRγ2shRNA序列,亚克隆到pRNAi-U6.1/Neo载体中,稳定转染,获得稳定的低表达ERRγ2的Ishikawa细胞。
3、免疫荧光结果显示:下调Ishikawa细胞中ERRγ2的表达可以明显诱导lshikawa细胞发生凋亡,并且抑制了Ishikawa细胞对雌激素的反应性。
4、流式细胞技术显示同样的结果:未转染细胞组,雌激素作用前的细胞凋亡率为23.51%,雌激素作用后的细胞凋亡率为9.78%;ERRγshRNA细胞组,雌激素作用前的细胞凋亡率为11.68%,雌激素作用后的细胞凋亡率为13.73%。
5、WesternBlot结果表明,雌激素可以使细胞内ERK活化,而下调了ERRγ2的水平则抑制了雌激素的作用。
结论：
ERRγ-shRNA(2,3)表达质粒对ERRγ基因表达有沉默作用。ERRγ基因表达沉默后能抑制子宫内膜癌Ishikawa细胞增殖,促进其凋亡,雌激素通过ERRγ对子宫内膜癌Ishikawa细胞起到促增殖作用,初步证实了ERRγ在子宫内膜癌细胞的发生和发展中发挥重要的作用。