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Lipocalin是一类成员众多,序列同源性较低的分泌型蛋白家族,广泛分布于细菌,植物和动物。其蛋白大小通常在18-20kDa左右,拥有保守的三维结构即都包含一个β折叠桶。传统上,lipocalin被认为在生物体内主要担任转运、贮存小分子配体的功能,常能结合一些低溶解度或化学不稳定的小分子,如维他命、甾体、嗅觉分子等。现在,人们逐渐认识到lipocalin蛋白也参与了许多重要的生理过程,如前列腺素合成,免疫应答,信号传导,调节细胞分化等。
哺乳动物的精子在睾丸生成后,还需要在附睾获得受精的能力,从而能够转变成有生育能力的成熟精子。精子在附睾中经历了生理,生化和形态上的变化。附睾里有不同的腔体环境,相关基因的表达也有着严格的时间和空点特异性。作为一种广泛分布并且功能众多的蛋白家族,lipocalin蛋白在附睾中也有着特异的分布。除了NGAL和L-PGDS等在全身广泛分布的lipocalin蛋白外,还有几种附睾特异性的lipocalin蛋白。Lcn12蛋白是一种在附睾中特异表达的蛋白,其分子量约为21kDa,属于lipocalin蛋白家族成员。Lcn12蛋白的表达受雄激素的调控,能在三周以上的小鼠附睾中检出。进化分析发现,Lcn12和NGAL和L-PGDS在同一进化枝,提示Lcn12可能具有和NGAL与L-PGDS同样重要的生理功能。
我们通过生物信息学的分析,构建了rLcn12野生型和C149A突变体的原核表达载体。通过比较,这个突变体克服了野生型蛋白质表达量低,稳定性差的缺点。我们利用常规的大肠杆菌表达系统,成功得到了稳定的,结构均一的蛋白质溶液样品。重组蛋白在溶液中以单体形式存在,以β折叠片为主要二级结构元件。质谱和SDS-PAGE分析均表明该蛋白内部有一个二硫键,这也和生物信息学的分析一致。我们优化了NMR实验条件,蛋白的二维1H-15NHSQC谱中谱峰分布广泛,强度比较均匀。
通过异核多维NMR技术,对rLcn12蛋白的谱峰进行归属,通过结构计算得到溶液中的三维结构。用4DNMR技术和TROSY技术进行谱峰归属,因为它们显著提高了谱峰的分辨率。rLcn12蛋白的结构域包括九个β折叠片以及1个310螺旋和一个长的α-螺旋。20个能量最优结构的主链和重原子的均方根偏差分别为1.04和1.31(A)。我们测定的rLcn12的溶液结构与大鼠NGAL蛋白的晶体结构相似性很高。两者β桶状结构的RMSD小于1(A),主要差别在于loop区域,这个区域也是lipocalin蛋白质发各自不同挥配体结合存在的物质基础。同时我们他能够过通过T1,T2和NOE实验对rLcn12蛋白在未结合配体条件下的动力学行为进行了研究。通过Model-Free分析,对rLcn12蛋白的动力学有了一定的了解。
用荧光滴定的方法,我们分析了rLcn12与几种疏水性小分子以及肠菌素的相互作用。rLcn12能和视黄酸有较高的亲和力,同时蛋白和疏水性荧光探针1,8-ANS也有中等强度的结合。虽然rLcn12蛋白在序列,三维结构上和NGAL有较高的相似性,但rLcn12和NGAL的配体肠菌素亲和度并不高。rLcn12和视黄酸的结合还随着pH的降低而下降。实验表明rLcn12与视黄酸的结合主要依靠疏水相互作用,而且这种结合明显受pH值的调控。rLcn12溶液结构的解析以及和小分子化合物的相互作用的研究有助于进一步阐明rLcn12在附睾中的生理功能。