论文部分内容阅读
γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase，GGT，EC2.3.2.2）在生物体中分布广泛，是生物体内谷氨酰循环中的关键酶，可特异性催化γ-谷氨酰基的转移反应。由于GGT反应具有严格的位点特异性，反应过程中无需对底物进行侧链保护和脱保护，且不消耗ATP等优点，该反应已广泛应用于催化多种γ-谷氨酰基化合物的生物合成。但是，由于GGT是一个异源二聚体蛋白，在体外催化环境下(pH＞8.5)极易发生亚基解聚，进而引发酶的不可逆失活，限制了其在生物催化领域的实际应用。 针对上述问题，本论文首先构建了Bacillus subtilis NX-2 GGT(B_GGT)和Escherichiacoli K12 GGT(E_GGT)的克隆、表达体系，实现了GGT的高效可溶性表达;在此基础上，对上述2种来源的GGT进行了催化特性和稳定性的比较研究，并从氨基酸组成和亚基间相互作用力的角度对其稳定性差异进行了分析;建立了基于亲和吸附的重组B.subtilisGGT(rB_GGT)纯化-固定化方法，并采用高分子聚合物—聚乙烯亚胺(PEI)对固定化酶进行修饰，以进一步提高固定化酶的稳定性。具体研究结论如下: (1)从Bacillus subtilis NX-2基因组中扩增得到了编码B GGT的基因，全长为1764bp，BLAST分析显示其与NCBI中已公布的B.subtilis str.168的GGT基因序列同源性达99.21％，氨基酸序列一致性达99.15％。该序列已提交Genbank，编号为JQ328191.1; (2)构建了表达载体pET22b-Bggt，并转化入E.coli BL21(DE3)，得到重组菌BL21(DE3)-pET22b-Bggt，并优化了其诱导条件。结果表明，在37℃下，重组菌生长约4h（至OD600约3.86）时，加入终浓度为2.5g/L乳糖，于24℃下诱导12h，发酵液酶活可达3.34U/mL。 (3)以亲和层析的方法对rB_GGT和重组E.coli GGT(rE_GGT)进行了纯化，获得了电泳纯的rB_GGT和rE_GGT，二者的比酶活分别为43.1U/mg和3.3U/mg。 (4)对rB_GGT和rE_GGT的酶学性质进行了比较研究。结果表明，rB_GGT和rE_GGT的最适反应pH均为pH9.0，两种酶在pH＞9.0条件下稳定性均较差;rB_GGT和rE_GGT的最适反应温度分别为50℃和45℃，当温度＜45℃时，rE_GGT的稳定性明显优于rB_GGT，而rB_GGT在高温下的耐热性相对较好;rB_GGT和rE_GGT对供体(GpNA)的亲和力常数Km分别为0.597mmol/L和0.0836mmol/L; rB_GGT对GpNA的催化数Kcat高达3.48×105s-1，远高于rE_GGT(1.51×104s-1); (5)考察了金属离子对GGT酶活的影响。结果表明，低浓度（2mmol/L）的Zn+和Co2+离子对rB_GGT和rE_GGT酶活具有促进作用;而高浓度（20mmol/L）的金属离子对酶活均有不用程度的抑制，其中Fe3+、Fe2+、Cu2+的抑制效果尤为明显。 (6)对rB_GGT和rE_GGT的氨基酸组成进行了分析。结果表明，rB_GGT中荷电氨基酸残基、疏水性氨基酸残基和芳香族氨基酸残基的数目均较rE_GGT略多，可提供更强的静电相互作用、疏水相互作用以及cation-pi作用力，有助于提高蛋白质二、三级结构的稳定性。 (7)采用Remap1.31对B.sutilis GGT(PDB ID:3A75)和E.coli GGT(PDB ID:2DBU)亚基作用面的相互作用力进行了分析。结果表明，B_GGT和E_GGT亚基间的相互作用以氢键和疏水键为主，键能较弱。E_GGT亚基间疏水键的数目多于B_GGT，使其在中低温条件下(＜45℃)表现出较好的稳定性。而随着温度的进一步提高，疏水键能已不足以维持其多亚基结构，E_GGT中较少的次级键使其二级结构的稳定性差，导致其在高温下失活较快。 (8)采用Ni亲和吸附对rB_GGT进行了纯化-固定化，固定化酶比活可达24.6U/g，但可能由于亲和载体与rB_GGT上His-Taq的专一性结合影响了酶的构象，导致固定化酶活回收率不高。 (9)固定化酶Ni-rB_GGT和Ni-rB_GGT-PEI的pH稳定性和热稳定性均优于游离酶。其中Ni-rB_GGT-PEI的pH稳定性提高尤为明显。Ni-rB_GGT和Ni-rB_GGT-PEI对GpNA的Km值分别为1.42mmol/L和14.22mmol/L，Ni-rB_GGT-PEI对酰基供体的亲和力下降明显，这可能是由于PEI覆盖在固定化酶表层形成了较大的传质阻力。Ni-rB_GGT-PEI和Ni-rB_GGT的失活反应活化能Ed分别为265.6kJ/mol和257.1kJ/mol，均较游离酶有所提高，表明通过PEI修饰固定化rB_GGT能提高酶的热稳定性，减缓酶的受热失活。