论文部分内容阅读
前言：
近年来,胰岛素类似物逐渐成为糖尿病治疗的首选[1]。虽然通过DNA重组技术产生的胰岛素类似物在分子结构上有别于人类胰腺产生的胰岛素,但其作用与人类胰岛素相同。胰岛素与类胰岛素生长因子(IGF)分别与其特定的受体胰岛素受体(IR)和类胰岛素生长因子受体(IGF-IR)相结合并在细胞增殖方面发挥一定的作用[2-3]。通过刺激受体促进生长增殖作用常常通过MAPK与PI3K-AKT信号传导通路介导来完成,该通路通过基因表达调节来影响细胞的生长及分化。胰岛素类似物的结构修饰可改变其与胰岛素受体或类胰岛素生长因子受体的亲和力,因此胰岛素类似物可能增强细胞的促有丝分裂能力。目前有文献报道大鼠乳腺细胞株B10Asp通过胰岛素类似物的刺激后具有很强促有丝分裂能力,因此对糖尿病病人使用胰岛素类似物治疗的安全性引起了越来越多学者的重视[4-6]。很多学者对胰岛素类似物刺激非致瘤性或癌症细胞株[正常人乳腺上皮细胞株(MCF10与HMEC)[9],人乳腺癌细胞株(MCF-7)[10],骨肉瘤细胞株(Saos/B10)。[11],肝细胞瘤细胞(HepG2)][12]后产生的促有丝分裂能力进行了研究,然而却得出了不同的结果。但这些结果却是通过不同的实验方法,不同的实验条件以及不同的统计方法获得。比如,有学者观察到胰岛素类似物可引起各种肿瘤细胞及人正常乳腺上皮细胞具有更强的增殖能力,但也有学者通过对各种细胞系进行了相似的研究,并未发现明确不同。甲状腺癌细胞对于胰岛素以及类胰岛素样生长因了的反应非常灵敏,同时常常过度表达胰岛素受体以及类胰岛素生长因了受体。因此,胰岛素类似物可能刺激甲状腺癌细胞而导致细胞的加速增殖。另外,Shukla[8]报道对于高类胰岛素生长因子受体/胰岛素受体比率的细胞株来说,甘精胰岛素对其具有强烈的促细胞分裂能力。通过文献复习,目前尚未发现关于胰岛素类似物对甲状腺乳头状癌细胞株(IHH4)作用的影响相关文献报道。
本篇文章的目的：
1.检测IHH4细胞株是否存在胰岛素受体以及类胰岛素生长因子受体以及其相关比值。2.研究目前应用于临床的胰岛素以及其类似物对IHH4细胞株的增殖影响.3研究在MAPK与PI3K-AKT通路中,胰岛素及其类似物作用IHH4细胞株后对ERK1/2蛋白与AKT蛋白的影响。
材料与方法：
一、实验材料
1.细胞株
甲状腺乳头状癌细胞株IHH4有内分泌研究所关海霞教授惠赠。
2.常规胰岛素及胰岛素类似物
门冬胰岛素insulinaspart(B28Asphumaninsulin),
赖脯胰岛素insulinlispro(B28Lys,B29Pmhumaninsulin),
甘精胰岛素insulinglargine(A21Gly,B31Arg,B32Arghumaninsulin),
地特胰岛素insulindetemir(NN304)[B29Lys(-tetradecanoyl),desB30humaninsulin]
优泌乐Rhumaninsulinregular
诺和灵Rhumaninsulinregular
二、主要研究方法
1、IHH4细胞株的培养。
2、MTT法测定药物对细胞是否存在促增殖作用。
噻唑蓝[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide,MTT](5mg/mL)染色法检测不同浓度的普通胰岛素及胰岛素类似物作用IHH4细胞株产牛的增殖作用。
3、Westernblot检测IR、IGF-IR、ERK12、pERK12、AKT、pAKT
收集细胞提取总蛋白,BCA法检测蛋白质含量。进行SDS-PAGE电泳,转印至PVDF膜。封闭,IR、IGF-1R、ERK12、pERK12、AKT、pAKT一抗孵育过夜,相应的二抗孵育,增强型化学发光(enhancechemiluminescence,ECL),拍照,以总ERK12及总AKT为内参照,进行条带灰度值分析。
4、计学分析
采用SPSS11.5统计软件包对数据进行统计分析,数据结果以±s表示,以P＜0.05为判断差异显著性标准。
结果：
1、IHH4细胞株类胰岛素样生长因子受体与胰岛素受体的表达
通过Westernblotting法对IHH4细胞株的类胰岛素样生长因子受体与胰岛素受体进行蛋白水平的检测,实验结果表明IHH4同时表达类胰岛素样生长因子受体与胰岛素受体,类胰岛素样生长因子受体与胰岛素受体相比较后,前者含量轻度高于后者,该实验中测得的两者的比值为1.36/1。
2、胰岛素与胰岛素类似物对IHH4细胞株的增殖影响
通过不同的浓度的普通胰岛素及胰岛素类似物(1.5nM,15nM和150nM)对IHH4细胞株进行增殖测定实验发现:普通胰岛素与胰岛素类似物作用该细胞株48小时后,普通胰岛素、赖脯胰岛素、地特胰岛素、门冬胰岛素与未处理组相比,对IHH4细胞株并无明显增殖活性作用,而甘精胰岛素对IHH4增殖活性作用略有增强。但经过对数据进行统计学分析,并未发现药物之间的统计学差异。
3、胰岛素与胰岛素类似物对IHH4细胞株ERK1/2蛋白及AKT蛋白活化影响
通过Westernblotting法对样品中的ERK1/2蛋白与AKT蛋白以及其磷酸化形式pERK1/2蛋白与pAKT蛋白含量进行检测,并以样品中的ERK1/2蛋白及PAKT蛋白作为内参照,比较不同样品通过不同刺激因素刺激后pERK1/2蛋白与pAKT蛋白含量的变化。本实验数据表明在不同的浓度刺激下未处理组,胰岛素类似物组及普通胰岛素组中的磷酸化蛋白pERK1/2蛋白与pAKT蛋白含量并未发牛明显的改变,统计学无明显差异。推断胰岛素类似物并不能激活MAPK与PI3K-AKT信号传导通路。
结论：
1、IHH4细胞株表达胰岛素受体及类胰岛素生长因子受体。
2、普通胰岛素及胰岛素类似物并不能通过与上述受体结合激活MAPK与IP3K-AKT信号传导通路从而对IHH4细胞株起到促进细胞增殖的作用。