猪水通道AQP1基因分子克隆、组织定位及功能分析

来源 :东北师范大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:l13633332021
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水通道蛋白(AQP)是广泛存在于各组织细胞膜上、选择性转运水分子的特异孔道。到目前为止已克隆的人和啮齿类动物水通道蛋白家族有13个成员(AQP0-AQP12)。对AQP基因突变人群的研究以及对AQP基因敲除小鼠的研究,揭示了AQP在肾脏尿浓缩机制、外分泌腺功能、大脑和眼球液体转运、神经传导、脑水肿形成以及肿瘤血管新生等多种组织生理及病理过程中发挥重要作用。 尽管对各种水通道分子生物学及生理功能研究都取得了很大的进展,除了人及啮齿类动物以外,其它模式动物水通道蛋白分子生物学及功能研究较少。哺乳动物中猪的器官形态和生理与啮齿动物相比更类似于人类,因此是体内研究水通道基因表达和基因功能更为理想的模型。然而,关于猪水通道蛋白的研究目前仍属空白。 本文应用基于PCR技术的同源克隆的方法,从猪的肝脏中克隆得到了猪的AQP1基因编码序列。猪的AQP1基因全长816bp,编码表达了由271个氨基酸组成的细胞膜水通道蛋白。猪的AQP1与其它的AQPs类似,具有六个高度保守的跨膜结构域及两个NPA保守区。猪的AQP1氨基酸序列与狗的AQP1同源性最高,为94%,与人及小鼠的同源性分别为93%和91%。Northernblot分析在猪的肝脏、唾液腺和肠道检测到长度约3.0kb的AQP1mRNA。猪AQP1基因结构与人AQP1相似,由三个内含子和四个外显子组成。多组织RT-PCR进一步表明猪的AQP1mRNA广泛表达于猪多种组织器官。免疫组织化学研究显示AQP1蛋白定位于唾液腺毛细血管内皮细胞、肝脏胆管上皮细胞和微血管内皮细胞、小肠中心乳糜管内皮细胞以及肾脏近曲小管、大脑脉络丛上皮、角膜内皮和中枢神经系统的一些神经元细胞。免疫印记分析在猪红细胞和稳定性转染的CHO细胞检测到非糖化(28kDa)和糖化形式(35-55kDa)的猪AQP1蛋白。通过真核表达载体将猪AQP1与氯离子敏感性绿色荧光蛋白突变体EYFP-H148Q-V163S稳定共转染CHO细胞建立了猪AQP1水通道功能测定模型。对猪红细胞和稳定转染的CHO细胞进行水通透性测定研究表明,猪的AQP1蛋白具有特异性高效转运水分子的功能,而且此功能可以被0.1mMHgCl2抑制。 该项研究克隆了第一个猪水通道基因,并系统研究了猪AQP1的功能、基因表达和组织定位,为进一步以猪为动物模型研究AQP1水通道在体内的调节和功能奠定了基础。同时也为AQP1水通道蛋白的比较生物学研究提供了一份实验材料。
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