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铬(Chromium,Cr)主要用于工业生产涂料,染料,油墨；镀铬,皮革鞣制；及木材贮存等。研究显示工人长期接触Cr(Ⅵ)可诱发肺癌。
有研究表明,在活体细胞内90％的抗坏血酸(ascorbate,Asc)参与Cr(Ⅵ)的还原代谢,且Asc是Cr(Ⅵ)的主要还原剂。在体外实验中Asc含量非常低,脱氢抗坏血酸(dehydroascrobate acid,DHA)孵育使细胞内Asc达到或接近机体的正常生理浓度。Reynolds等发现在对H460和IMR90细胞孵育DHA90 min后,再用Cr(Ⅵ)染毒细胞,细胞急性毒性增强。Takahashi等研究认为hMLH1和hMSH2基因在铬酸盐接触者肺癌患者的失活率高于非铬酸盐接触者肺癌患者的失活率。
目的:
探讨DHA在Cr(Ⅵ)致细胞损伤中的作用,为进一步研究Cr(Ⅵ)致癌及预防提供理论依据。
方法：
1.孵育用DHA浓度为0.6 mmol/L的无血清培养液。DHA先溶于DMSO,DMSO在无血清培养液中的体积分数为0.2％。Cr(Ⅵ)染毒液由重铬酸钾配制。实验分组为阴性组、溶剂组、实验组A和实验组B。阴性组为空白对照组,溶剂组为仪DHA溶液孵育90 min未有Cr(Ⅵ)处理组,实验组A为单独Cr(Ⅵ)处理组,实验组B为DHA孵育90 min后Cr(Ⅵ)处理组。
2.DHA孵育后对A549细胞生长曲线的影响。实验分组为阴性组、溶剂组、实验组A和实验组B,共观察6 d。Cr(Ⅵ)染毒浓度为10μmol/L处理时间为3 h。
3.DHA孵育后对A549细胞增殖的影响。Cr(Ⅵ)以0.00、1.25、2.50、5.00μmol/L染毒A549细胞24 h,分析实验组A、B的细胞增殖的影响。
4.DHA孵育后对hMLH1、hMSH2、p53表达的影响。以Cr(Ⅵ)0.00、1.25、2.50、5.00μmol/L染毒A549细胞24 h,提取总RNA,进行逆转录后进行实时荧光定量PCR(real time PCR)分析,检测hMLH1、hMSH2、p53 mRNA的表达水平。
5.Western blot方法检测Cr(Ⅵ)作用24 h后hMSH2在蛋白水平上的表达情况。使用Bioimaging System成像分析系统扫面,Gene Tool软件分析蛋白表达情况。
6.运用SPSS12.0统计软件,Kolmogorov-Smirnov正态性检验、Levene方差齐性检验、t检验和单因素方差分析对数据进行统计分析；采用Pearson相关进行相关性分析(检验水准α=0.05)。
结果：
1.阴性组和溶剂组A549细胞生长状况良好,在第4 d达到,上长高峰,随后出现增殖抑制现象；实验组A、B中A549细胞增殖被六价铬抑制,与阴性组比较,有统计学意义(P＜0.05)；实验组A、B比较,实验组B中A549细胞增殖抑制程度更强,有统计学意义(P＜0.05)。
2.实验组A、B的抑制率有差别,有统计学意义(P＜0.05)；实验组A、B的IC50分别为:13.04μmol/L和3.34μmol/L,二者的急性毒性之比约为1:4。
3.实验组B基因mRNA相对表达量低于实验组A,有统计学意义(P＜0.05)。
4.实验组BhMSH2蛋白相对表达量低于实验组A,有统计学意义(P＜0.05)；在实验组B中,随染毒剂量增加hMSH2蛋白表达降低；实验组A中hMSH2蛋白的表达在Cr(Ⅵ)浓度为1.25μmol/L时较0.00μmol/L时升高,有统计学意义(P＜0.05),在2.50～5.00μmol/L时,随染毒剂量增加,蛋白表达降低,与0.00μmol/L比较,有统计学意义(P＜0.05)。
结论：
1.DHA在Cr(Ⅵ)致细胞毒性中起到了促进作用。
2.hMLH1、hMSH2和p53在A549细胞中mRNA的农达及hMSH2蛋白的表达在低剂量Cr(Ⅵ)染毒时表达升高,在高剂量Cr(Ⅵ)染毒时表达降低。