论文部分内容阅读
目的:学习R语言生物信息技术。通过生物信息技术筛选备选lncRNA。利用实验技术探究备选LncRNA在样本组织中是否存在差异表达。以及这些LncRNA表达量是否与WHO(World Health Organization)分级相关。对组织中确实存在差异表达的基因做细胞功能实验。验证敲减指定lncRNA是否会引起肿瘤细胞的增殖侵袭迁移功能发生改变。为胶质瘤的诊断和治疗确定可能分子标志物和治疗靶点。方法:应用TCGA数据库筛选差异基因。研发R语言代码,批量计算这些差异基因的ROC曲线(Receiver operating characteristic)。将ROC曲线下面积(area under the curve,AUC值)>0.85的基因筛选出来利用starbase提供的“ceRNA预测网络”构建这些差异基因的ceRNA网络。利用Cytoscope 3.6软件对这个ceRNA网络做分析,鉴定出基因内部连接度处于前10%的hub genes。在hub genes中随机选区4个研究较少的lncRNA做样本组织内的qPCR,判断是否存在差异表达,以及其表达量与WHO分级是否相关。最终我们选中ASB16-AS1进行功能实验。选用siRNA技术对ASB16-AS1进行敲减。功能实验U87和U251在生长因子刺激下孵育出的胶质瘤干细胞样细胞(glioblastoma stem-like cells)——U87GS和U251GS,每个细胞系设三个组别:NC组(Negative control,转染NC siRNA),siRNA-1组(转染ASB16-AS1 siRNA-1),siRNA-2组(转染ASB16-AS1 siRNA-2)。功能实验使用了RTCA(Real-time cellular analysis)技术用于检测细胞在敲减增殖、侵袭、迁移能力的改变。使用流式细胞周期技术检测细胞周期有无阻滞。结果:差异分析一共鉴定出178个差异lncRNA,且他们的ROC曲线下面积>0.85。根据这些基因的symbol和starbase v2.0提供的ceRNA预测网络数据,共计鉴定出1650条预测ceRNA关系。并不是所有差异基因都能在starbase v2.0找到预测关系。共计只有72个lncRNA被包括在输出ceRNA中。差异基因的ceRNA网络共计417个节点。前10%连接度的hub gene共计42个。去除其中非lncRNA和报道比较多的lncRNA。我们保留了HOXA-AS2、HOTAIRM1、ASB16-AS1、LINC00339做临床样本的qPCR验证。结果提示只有ASB16-AS1在我院临床样本中存在显著差异表达且和胶质瘤分期分级正相关(正常组1.01±0.84,低等级胶质瘤4.34±2.69,高等级胶质瘤11.29±6.33,但因素方差分析P<0.01)。ASB16-AS1的表达量与胶质瘤诊断正相关,ROC分析显示其曲线下面积达到0.94。在TCGA数据库中ASB16-AS1在肿瘤组织中较正常组织显著上调(正常组1.36±0.70,肿瘤组4.03±1.67,t检验P<0.05),在肿瘤组中复发组和原发组ASB6-AS1的表达量无明显差异(复发组3.59±1.92,原发组4.07±1.65,t检验P>0.05)。siRNA敲减后qPCR检测得知本实验所使用siRNA-1、siRNA-2能有效敲减ASB16-AS1,抑制效率达到50%左右。RTCA增殖、侵袭、迁移实验结果证实肿瘤细胞在ASB16-AS1敲减后增殖侵袭迁移能力显著减弱(P<0.001)。流式细胞周期实验证实在ASB16-AS1 siRNA组U87GS和U251GS G2/M期发生显著上升(U87GS NC19.3±4.2,si 30.9±5.5;U251GS NC 18.3±3.2,si 27.9±4.6,P<0.05)。结论:ASB16-AS1的表达量在胶质瘤组织中较正常组织显著上调,并且其表达量随着胶质瘤等级的增加而增加。ASB16-AS1参与胶质瘤进展,在胶质瘤U87,U251细胞系中敲减ASB16-AS1能显著影响胶质瘤的增殖侵袭迁移能力。ASB16-AS1是潜在的生物学标志物和药物靶点。