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目的:Wnts组成的信号蛋白家族在肾脏的生长中起重要作用,但是他们的表达在成熟肾脏中被认为是静默的。Wnt信号的异常调节涉及许多不同组织类型的人类疾病的发病机制,急性肾损伤(AKI)是临床常见病多发病,许多原因可导致急性肾损伤,其损伤机制最终大多是通过减少肾血流量导致缺血损伤。然而损伤的肾脏上皮细胞,与心脏和脑组织不同,在结构和功能上是可以完全恢复的,虽然肾脏有强大的自我修复能力,但许多急性肾损伤的患者并不能完全恢复而转为慢性肾脏病(CKD)以至发展到终末期肾病(end stage renal disease, ESRD)。而目前临床上对由AKI导致的CKD及ESRD的治疗只是在控制其发展速度延缓病程,不能根本改善病人的预后。探讨急性肾损伤的发病机制及其防治措施,阻断其向CKD的发展一直为肾脏科领域的研究热点。本研究利用Wnt/β-catenin信号通路转基因报告鼠和C57BL/6野生型小鼠观察Wnt/β-catenin经典信号通路及其激动剂在正常肾脏和急性肾损伤后恢复过程中肾脏的表达和调节;观察经典的Wnt信号通路的激活及对急性损伤后修复的影响。探讨Wnt/β-catenin信号通路在急性肾损伤后的修复机制中的作用,为急性肾脏损伤后的干预治疗提供一新思路。方法:(1)利用Wnt/β-catenin信号通路转基因报告鼠(BAT-gal小鼠)建立单侧肾脏缺血再灌注急性肾损伤(ischemina reprefersion injury, IRI)模型,了解小鼠体内Wnt信号分布和表达的变化,BAT- gal的表达等同于新奇的Wnt信号位点。IRI后于第0天、3天、5天不同时间点取肾脏组织,与正常小鼠比较,对整个肾脏及肾组织冰冻切片行X-gal染色,同时取血测血肌酐。(2)利用C57BL/6小鼠建立单侧肾缺血再灌注损伤模型,分别与第0天、2天、5天、7天取血及留取肾脏组织标本。采用ELISA方法检测血肌酐的变化;Western blot检测Wnt/β-catenin通路上的wnt4蛋白及其受体Lrp6在肾缺血损伤后不同时间点表达的变化。同时对肾组织切片进行肾病理分析,评定小管间质损伤程度。另外于肾缺血再灌注后12hs始至48hs每12hs给予重组的Wnt/β-catenin信号通路的激动剂DKK2-C2腹腔内注射,IRI后d5留取肾组织标本,检测肾组织病理和pLRP6蛋白的变化。(3)应用BAT-gal转基因报告鼠建立单侧缺血再灌注肾损伤模型,分别与d0、d2、d5留取肾脏组织标本。利用免疫荧光组织化学双重染色技术对肾组织切片行X-gal/CD31(内皮细胞marker)、X-gal/PDGFβ(外周细胞marker)、X-gal/α-SMA(成纤维细胞/平滑肌细胞marker)、X-gal/F4/80(巨噬细胞marker)、X-gal/LTL(近曲小管marker)、X-gal/NKCC2(髓袢marker)、X-gal/DBA(集合管marker)双染,观察肾损伤后Wnt经典信号通路参与修复过程中哪些细胞对Wnt/β-catenin信号产生了应答以及来源。(4)选择在我院肾内科住院并行肾病理检查,符合急性肾小管坏死致急性肾损伤诊断的患者,分为肾病综合征微小病变、微小病变并急性肾小管坏死的两组病人,了解各组患者血肌酐的改变;石蜡切片行PAS染色观察各组肾病理小管间质损伤程度并进行评分;星狼红染色观察各组病例肾组织中小管间质中纤维化的程度;Ki67, Tunel染色观察各组病例肾组织中小管上皮细胞凋亡和增殖的变化;免疫组化染色观察各组病例肾组织中Wnt/β-catenin信号蛋白表达的变化。结果:(1)成熟鼠肾组织X-gal染色,正常BAT-gal小鼠肾脏内可见到Wnt/β-catenin信号主要分布在肾乳头,而在皮质和外髓没有表达。在IRI后第3天和第5天可见到肾皮质和外髓有大量的蓝色阳性信号高表达。提示肾损伤后Wnt/β-catenin信号通路被诱导应答;在对照组野生型小鼠肾内Xgal染色阴性。(2)对肾组织切片进行PAS染色结果分析显示:损伤肾脏的肾小管上皮细胞排列紊乱,可见明显的肾小管上皮细胞脱落及基底膜裸露,管腔内可见脱落的细胞和细胞碎片; 7天时小鼠肾小管上皮细胞损伤面积较2天时明显缩小。小管间质损伤程度评分显示在IRI后第2天损伤最重,第5天和第7天明显好转;对血肌酐监测结果示IRI后逐渐增高,第2天时达峰值,以后逐渐下降,此两项指标说明IRI小鼠肾损伤后第2天始开始修复。western blot结果提示Wnt4于IRI后2天增高,第5、7天较第2天明显增高;其共同受体phospho-Lrp6代表激活的Wnt/β-catenin信号,在IRI 2天后增高明显,而在无损伤成鼠肾组织中未能检测到。给予DKK2的小鼠IRI后第5天phospho-Lrp6蛋白较对照组明显增加,而肾组织小管上皮细胞损伤面积也明显缩小。(3) X-gal染色显示第2天损伤的肾脏皮质和外髓质层中可见少数肾小管出现Wnt信号的表达,主要表达在间质的一些细胞中,第5天与第2天比较Wnt信号表达明显增强;损伤后肾脏组织X-gal染色显示Lacz在肾小管上皮细胞被检测到,免疫双染提示为近曲小管和髓袢的上皮细胞对Wnt信号通路应答,集合管上皮细胞上没有Lacz阳性;在损伤后肾组织切片Lacz和细胞的双标记中显示,肾间质细胞中内皮细胞和外周细胞对Wnt信号通路应答,而巨噬细胞和成纤维细胞是阴性结果。计数肾皮质和外髓质β-gal染色阳性的内皮细胞发现,未损伤时肾皮质无X-gal和CD31(内皮细胞)及PDGFβ(外周细胞)共染阳性的细胞,而IRI后第5天明显增加。肾血管上对Wnt信号应答的细胞是平滑肌细胞而不是内皮细胞。(4) MCD组和MCD伴ATN组患者各20例,男性18例,女性22例,平均年龄31±12岁vs 38±15岁;伴有ATN的患者肾病理PAS染色结果显示一些肾小管上皮细胞脱落及基底膜裸露,管腔内可见脱落的细胞和细胞碎片;与无ATN的对照组比肾小管损伤评分增加(17.15% vs 3.84% P<0.01)肾组织内肾小管上皮细胞凋亡也明显增加(16.52±9.18 vs 5.14±3.28 P<0.001),细胞增殖亦有增加但两组间差异不明显(32.18±19.82 vs 30.09±12.81 P>0.05),肾小管间质内胶原沉积面积明显增多( 1.39±1.25% vs 0.12±0.09% P<0.05);Wnt4蛋白主要在损伤的肾小管上皮细胞内表达,偶见散在表达于肾小球;β-catenin的表达在肾小管上皮细胞内,尤其是损伤的肾小管;两组间比较有明显差异(分别为1.64±0.55% vs 1.0±0.44%,8.02±4.37% vs 3.83±2.08% P均<0.05)。Wnt4的表达是与肾脏β-catenin的浓度密切相关(r=0.864),他们的表达与患者肾小管损伤评分、肾小管上皮细胞凋亡及小管间质胶原沉积成正相关;可能受细胞增殖数量增加不明显的影响,使Wnt4和β-catenin两种蛋白的表达与细胞增殖间没有相关性。结论: (1) Wnt/β-catenin信号通路在正常成熟肾脏内有表达,主要位于肾乳头区;IRI后Wnt/β-catenin信号通路被激活,在肾皮质和外髓质层表达。(2) IRI后2天损伤开始修复,Wnt蛋白的表达增强及其共同受体Lrp6磷酸化增加,于IRI后第5、7天持续增强,提示Wnt/β-catenin通路参与缺血后急性肾损伤的修复机制;给予Wnt/β-catenin通路激动剂DKK2治疗可增强此通路的作用,促进急性肾损伤后的修复。(3)损伤肾脏中小管上皮细胞和间质中的外周细胞、内皮细胞参与了Wnt/β-catenin信号的应答,肾血管的平滑肌细胞亦对Wnt/β-catenin信号产生反应,而巨噬细胞可能是Wnts的递呈细胞,从而启动Wnt信号通路,这些细胞可能参与肾损伤的修复过程。(4)在人类,急性肾小管坏死所致肾损伤时Wnt/β-catenin信号通路被激活,同哺乳动物小鼠相同,推测Wnt/β-catenin参与了肾小管上皮细胞的修复机制。