论文部分内容阅读
目的:本实验探讨浓缩生长因子(concentrated growth factors,CGF)对矿化胶原(mineralized collagen,MC)材料表面人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)黏附、增殖和分化的影响,从而为CGF和MC材料在口腔医学和骨缺损再生修复领域的联合应用提供理论基础。研究方法:1、经中国医科大学附属口腔医院伦理委员会批准并获得志愿者知情同意,抽取健康志愿者肘部静脉血,通过CGF血纤维蛋白离心机制备成CGF凝胶,再利用CGF凝胶制备出浓缩生长因子提取液(concentrated growth factor extracts,CGFe)。2、材料获取:材料由北京奥精公司提供,为直径10mm、厚度2mm的矿化胶原材料。3、通过扫描电子显微镜(scanning electron microscopye,SEM)观察MC材料表征。4、获得hBMSCs细胞系,观察hBMSCs形态。5、将提取CGFe加入培养基,制备成四组培养基,分别培养hBMSCs。实验组A:含2%CGFe的α-MEM培养基(10%FBS),实验组B:含5%CGFe的α-MEM培养基(10%FBS),实验组C:含10%CGFe的α-MEM培养基(10%FBS),对照组D:不含CGFe的α-MEM培养基(10%FBS)。6、通过SEM观察不同浓度CGFe培养基对接种在MC材料上的hBMSCs黏附情况的影响。7、通过CCK-8(cell counting kits-8)法检测不同浓度CGFe培养基对接种在MC材料上的hBMSCs增殖的影响,并绘制生长曲线。8、将hBMSCs进行成骨方向诱导,即按浓度梯度制备出四种含不同浓度的CGFe的成骨诱导培养液(含地塞米松,β-甘油酸钠,维生素C,10%FBS,1%双抗),分组同上,分别诱导细胞。9、通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性法检测不同浓度CGFe对接种在MC材料上的hBMSCs的ALP活性的影响。10、通过Western blot法检测不同浓度CGFe对接种在MC材料上的hBMSCs的骨桥蛋白(osteopontin,OPN)表达的影响。结果:1、MC材料表征:MC材料表面疏松有孔,SEM下显示为孔径大小不一的三维多孔材料,孔径范围在50～500μm之间,孔隙率大于70%。2、hBMSCs细胞形态:hBMSCs贴壁初期为圆形、梭形,在培养时间增加的同时,细胞数量逐渐增加,形态逐渐成为长梭形或星形,紧密排列呈螺旋状或平行状,漩涡状生长。3、CGF凝胶:静脉血离心得到的三层分离结构,最上层呈淡黄色液体,流动性佳;最下层为红色胶冻样物质,质地疏松。离心管中间层为纤维蛋白层,呈半透明淡黄色的凝胶状物即为CGF,其表面光滑,质地柔韧有弹性。4、SEM观察细胞在MC材料上黏附生长:接种24h后,细胞黏附在MC材料表面上及孔隙内,细胞在各组培养基的培养下均有不同程度铺展,呈多角形、长梭形。不含CGFe的对照组细胞铺展良好,伸出较短较少的伪足;含有不同浓度CGFe实验组较对照组细胞伸出伪足长,末端深入材料孔隙内。5、CCK-8检测结果:在培养时间延长的同时,各组OD值均逐渐增加,生长曲线呈S型,在含有不同浓度CGFe培养基下培养的细胞增殖能力均大于不含CGFe的对照组。其中,在每一时间点,10%CGFe组的OD值最高(p<0.05)。6、ALP活性检测结果:各组细胞的ALP活性均随着时间的延长而增高。在各个时间点,在含有不同浓度CGFe培养基下培养的细胞的ALP活性均高于不含CGFe的对照组。在第7d、14d各组的差异具有统计学意义(p<0.05)。7、Western blot检测结果:各组得到的OPN蛋白均有表达,2%、5%和10%组的OPN蛋白水平均明显高于对照组,且随着CGFe含量增高,OPN蛋白水平亦有所增高,第14d各组间比较差异有统计学意义(p<0.05)。结论:1、hBMSCs在MC材料上生长良好,MC材料具有良好的生物相容性。2、CGF能有效地促进MC材料上hBMSCs的黏附、增殖及成骨分化。3、CGF浓度在本实验设置的条件下,CGF促进作用与其浓度呈正相关关系,10%CGF促进作用最为显著。