嗜碱芽孢杆菌N16-5糖代谢分子机制的研究

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嗜碱芽孢杆菌N16-5具有广泛的底物谱,可以利用多种常见的五碳糖、六碳糖以及多糖快速生长。本文通过分析该菌在不同底物条件下的转录组数据,从全局角度对其糖代谢途径和调控机制进行了研究,重点分析了其快速有效利用甘露聚糖、木聚糖和果胶的分子机制,并对一个新的甘露寡糖ABC家族转运蛋白进行了性质表征。  使用单通道agilent8×15k全基因组表达谱芯片研究了菌株N16-5在葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、木聚糖、半乳甘露聚糖、果胶和羧甲基纤维素钠等十种条件下的基因差异表达。根据不同条件下高表达的基因鉴定出了代谢甘露糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、木聚糖、半乳甘露聚糖和果胶所需的基因簇。通过对单糖基因簇进行分析,得到了该菌的单糖代谢途径,并对相关转运蛋白进行了功能预测。其中,甘露糖,果糖的转运蛋白为PTS系统,而木糖,阿拉伯糖的转运则可能依靠来自MFS家族的转运蛋白。在对菌株N16-5的多糖转录组数据进行分析的过程中,鉴定得到了三个分别代谢甘露聚糖,木聚糖和果胶的基因簇,通过对其所编码的蛋白进行功能分析,发现了大量多糖降解相关的胞内酶和转运蛋白。这些转运蛋白都来自CUT1家族,由于该家族成员只负责转运二糖、寡糖、甘油磷酸和多元醇等物质,不能转运单糖,因此推测寡糖转运在该菌的多糖利用中起到了重要作用。而菌株N16-5具有快速有效利用多糖的能力则很可能源于高效的胞外内切酶,特定的寡糖转运蛋白以及丰富的胞内降解酶系的协同配合。  生理测定显示菌株N16-5对碳源的利用具有偏好性,葡萄糖作为最适碳源抑制其他单糖的利用,Real-timePCR结果显示葡萄糖的存在也抑制多糖基因簇上基因的转录,而在菌株N16-5的基因组中发现了碳代谢抑制机制(CCR)中的关键蛋白CcpA、Hpr和Hpr激酶的编码基因,上述结果都符合CCR的特征,因此,菌株N16-5的糖代谢很有可能受到该机制的全局调控。  菌株N16-5的甘露聚糖基因簇编码一个疑似甘露寡糖ABC转运蛋白,将其膜外底物结合蛋白和两个穿膜蛋白分别命名为ManH、ManI和ManJ。为了测定该转运蛋白的底物特异性,我们将其底物结合蛋白ManH进行了基因克隆、表达和纯化,并使用等温滴定量热法(ITC)对其与各种糖的结合性质进行了测定。滴定结果显示,在所有测试的底物中ManH只对甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖、甘露六糖和半乳甘露三糖有明显的结合曲线,对其他底物没有结合反应,因此ManH是一个甘露寡糖结合蛋白,其所属的ABC转运蛋白则为一个甘露寡糖转运蛋白。作为在革兰氏阳性菌中第一个性质表征的甘露寡糖ABC转运蛋白底物结合蛋白,ManH的发现对于这类蛋白的注释和认识将起到重要的作用。  为了研究ManH在菌株N16-5甘露聚糖利用过程中所起的作用,我们构建了manH缺陷株及功能回补菌株,并测定了它们对甘露聚糖底物的利用能力。结果证实基因manH的敲除确实极大影响了菌株N16-5快速高效利用甘露聚糖生长的能力,而manH回补株的性状则恢复到了野生株的水平。本实验证明ManH作为甘露寡糖转运蛋白底物结合蛋白,确实在菌株N16-5的甘露聚糖利用过程中起到了重要的作用。此外,通过对ManH的相似序列进行分析,在其他菌株中也发现了与菌株N16-5相似的甘露聚糖基因簇,说明这些不同来源的菌株很可能具有与菌株N16-5相似的甘露聚糖利用机制,而这种依赖于寡糖的甘露聚糖利用方式有可能广泛的存在于许多微生物类群之中。
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