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研究背景和目的肺癌是目前世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,已经成为癌症病人死亡的最常见原因。肺癌中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占所有病例的80%左右,大多数NSCLC患者被发现时已处于局部晚期或晚期,总体的五年生存率仅为15%左右[1]。以吉非替尼为代表的表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs)已经用于EGFR (epidermal growth factor receptor, EGFR)突变型晚期NSCLC的一线、二线、三线治疗,对EGFR野生型NSCLC的有效率也达到5%-6%[2],然而耐药现象的出现成为制约EGFR-TKIs进一步应用的瓶颈,使得患者使用EGFR-TKIs的中位有效时间仅为8-10个月。因此,研究和发现EGFR-TKIs获得性耐药机制,积极寻找逆转耐药的新方法具重要的临床意义。目前认为EGFR突变型NSCLC细胞对EGFR-TKIs获得性耐药的主要相关机制为EGFR基因的二次突变(20外显子T790M突变)及Met基因的扩增,二者所占比例分别为50%和20%左右,其中约10%重叠,故这两种机制覆盖了约60%的EGFR-TKIs获得性耐药[4-8]。针对上述耐药机制研发的多种不可逆的新一代EGFR-TKIs(如HKI-272, ERK-569, CI1033, AZD9291, BIBW2992)已逐渐从基础研究走向临床。但目前存在的问题是,仍有约40%的EGFR突变型NSCLC的获得性耐药机制以及EGFR野生型NSCLC的获得性耐药机制尚未明确。其中可能包括EGFR信号转导通路以外的旁路激活(如IGF-1R等)信号通路的激活、EGFR下游信号转导通路中的分子异常活化、EML4-ALK融合基因、蛋白酪氨酸磷酸酶基因(PTEN)的缺失及细胞EMT的发生等[11-13]其中IGF及其受体IGF-1R信号通路激活介导的对EGFR信号通路的旁路激活及细胞EMT尤为引人关注。IGF-1R是一种跨膜的酪氨酸蛋白受体,广泛表达于多种类型的细胞表面,对细胞的分裂、分化和增殖起重要的调控作用。IGF-1R与配体结合,通过激活2条主要的信号转导通路：磷酯酰肌醇3-激酶/蛋白激酶(PI3K-AKT)信号转导通路和丝裂原激活的蛋白激酶(ERK/MAPK),促进有丝分裂及细胞生长[14]。IGF-1R在多种肿瘤中表达,它的异常表达/高表达在NSCLC等恶性肿瘤的持续生长中起着重要作用[15]。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transitions, EMT)是以上皮标志物E-cadherin的减少或缺失以及间质标志物(如Vimentin)的增多为主要特征的生物学过程,它的发生通常伴随着多条信号通路的激活。其发生是多种因素参与的病理反应,它不仅在胚胎发育、慢性炎症、组织重建和多种纤维化疾病中发挥着重要作用,而且存在于多种肿瘤的发展过程中,并与肿瘤细胞的原位侵袭和远处转移有密切关系们,与NSCLC的预后[20]及对EGFR-TKIs敏感性[21-23]密切相关。新近的研究发现,IGF-1R的激活及肿瘤细胞EMT与某些NSCLC细胞EGFR-TKIs获得性耐药密切相关。本课题组的前期研究也已证实,EGFR野生型的NSCLC细胞H460在EGFR-TKIs获得性耐药过程中发生了EMT,并且IGF-1R信号蛋白表达增多,提示EMT及IGF-1R信号转导通路可能在EGFR野生型NSCLC获得性耐药过程中起重要作用。Rho等发现,EGFR野生型NSCLC细胞对EGFR-TKIs获得性耐药过程中发生EMT的同时伴随p-AKT表达的增多及p-ERK水平的降低,且并不伴有EGFR的激活,表明EMT很可能由PI3K/AKT信号通路介导。亦有研究显示,IGF-1R及其下游信号转导通路的激活不仅可介导对EGFR信号通路的旁路激活过程,也可能对包括EGFR野生型NSCLC在内的多种肿瘤细胞产生EMT起重要作用。因此,我们推测：IGF-1R及其下游信号通路的激活很可能介导了细胞EMT的发生而导致EGFR野生型NSCLC细胞对EGFR-TKIs产生获得性耐药,然而关于IGF-1R活化与EMT产生的确切因果关系及其介导的EGFR信号旁路激活在EGFR野生型NSCLC细胞对EGFR-TKIs耐药过程中的具体作用机制仍未完全阐明,其可能的分子学机制亦有待进一步研究。虽然已有研究证实应用IGF-1R酪氨酸激酶抑制剂或敲除IGF-1R基因表达可逆转EGFR野生型NSCLC对厄洛替尼的耐药,但抑制IGF-1R逆转EGFR野生型NSCLC细胞获得性耐药的分子学机制如何及其对细胞EMT的影响,在国内外尚未见报道。因此,在课题组前期工作的基础上,本课题拟通过构建靶向IGF-1R基因的RNAi慢病毒表达载体感染EGFR野生型NSCLC细胞,沉默IGF-1R基因的表达,观察IGF-1R基因对EGFR野生型NSCLC细胞产生EGFR-TKIs获得性耐药及发生EMT的影响,探讨抑制IGF-1R能否逆转EGFR野生型NSCLC细胞对EGFR-TKIs产生获得性耐药及其可能的分子学机制,为提高EGFR-TKIs疗效寻找新靶点和新方法。方法1、选用EGFR野生型的人肺腺癌细胞H460和A549,分别用厄洛替尼和吉非替尼将其诱导成耐药的H460/ER和A549/GR细胞。高分辨率溶解曲线分析技术(Quantitative PCR high-resolution melting, qPCR-HRM)检测H460/ER和A549/GR细胞EGFR及Kras基因突变；MTT法检测各组细胞的增殖情况。2、利用GV248质粒构建靶向IGF-1R的siRNA表达载体和阴性对照载体,并用PCR电泳鉴定；经过鉴定测序的构建好的载体质粒转染293T细胞,用Western Blot外源筛选有效RNAi载体；选择敲除效果良好的慢病毒载体进行包装并测定滴度；慢病毒感染目的细胞H460/ER和A549/GR,并确定转染效率；用实时荧光定量PCR和Western Blot法分别从mRNA水平和蛋白水平检测对目的基因IGF-1R表达的抑制效应。3、IGF-1R稳定抑制后,MTT法测H460/ER细胞增殖情况的变化、划痕实验和Transwell实验检测H460/ER细胞转移和侵袭能力的改变、Western Blot检测H460/ER细胞IGF-1R信号通路分子及EMT相关分子的蛋白表达。4、统计方法采用SPSS13.0软件进统计学分析,结果数据以X±s表示。两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,组间比较用LSD检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果1、H460/ER和A549/GR细胞对EGFR-TKIs敏感性下降MTT法检测结果显示,H460、H460/ER、A549和A549/GR细胞均呈无限繁殖。H460和H460/ER细胞对厄洛替尼的增殖作用显示为浓度依赖性作用,H460/ER细胞对厄洛替尼的敏感性较H460细胞显著下降,IC50值分别为52.66±2.79和12.22±0.55μmol/L(P<0.05)。 A549和A549/GR细胞对吉非替尼的增殖作用显示为浓度依赖性作用图,A549/GR细胞对吉非替尼的敏感性较A549细胞显著下降,IC50值分别为41.84±3.70μmol/L和9.73±1.29μmol/L(P<0.05)。以上结果说明,H460/ER和A549/GR细胞对EGFR-TKIs产生了获得性耐药。2、H460/ER和A549/GR细胞的EGFR和K-ras基因突变状况基因突变检测结果显示,H460/ER细胞为EGFR基因及K-ras基因野生型,A549/GR细胞为EGFR基因第19、20、21外显子野生型,18外显子未测出,K-ras基因3外显子野生型,2外显子未测出。3、靶向IGF-1R基因的RNAi慢病毒载体的构建及其对H460/ER和A549/GR细胞IGF-1R表达的抑制效应针对IGF-1R基因成功构建了3条shRNA慢病毒载体IGF1R-siRNA-1、 IGF1R-siRNA-2、IGF1R-siRNA-3及阴性对照载体IGF1R-siRNA-NC; Western Blot外源筛选出有效RNAi载体IGF1R-siRNA-3并进行病毒包装,获得了较高滴度的慢病毒颗粒；感染结果显示该慢病毒载体能稳定高效转染H460/ER和A549/GR细胞,结果表明IGF1R-siRNA-3慢病毒对H460/ER细胞IGF-1R的mRNA抑制率达67.7±2.6%,蛋白抑制率达86.6±1.6%,对A549/GR细胞无明显抑制效应。4、IGF-1R基因沉默对H460/ER细胞EGFR-TKIs敏感性的影响MTT法检测结果显示,siControl H460/ER和siIGF-1R H460/ER细胞均呈无限繁殖,它们对于厄洛替尼的增殖作用均显示为浓度依赖性作用(图2-IB); siIGF-1R H460/ER对厄洛替尼的敏感性较siControl H460/ER细胞显著升高,IC50值分别为6.29±1.56和65.34±3.30μmol/L (P<0.05)结果说明,靶向IGF-1R基因沉默后,H460/ER细胞对EGFR-TKIs耐药性显著降低。5、IGF-1R基因沉默对H460/ER细胞IGF-1R信号转导通路相关蛋白表达的影响Western Blot结果显示,靶向IGF-1R基因沉默后,H460/ER细胞中IGF-1R蛋白及其磷酸化表达显著降低(P<0.05),p-AKT和p-ERK表达水平下降(P<0.05),而EGFR蛋白及其磷酸化表达均未见明显变化(P>0.05)。6、IGF-1R基因沉默对H460/ER细胞EMT的影响(1)与阴性对照siControl H460/ER细胞相比,靶向IGF-1R基因沉默的siIGF-1R H460/ER细胞形态由纺锤型倾向鹅卵石型发展,伪足减少,且有极性,符合间质细胞向上皮细胞形态学转变表现；(2)划痕实验结果显示,靶向IGF-1R基因沉默后,H460/ER细胞划痕两边缘距离均明显变长：siIGF-1R H460/ER与siControl H460/ER细胞相比距离延长61%(P<0.05)。侵袭实验结果显示,IGF-1R基因沉默后的H460/ER细胞穿过Matrigel胶的细胞数明显低于阴性对照细胞：siIGF-1R H460/ER细胞穿过Matrigel胶的细胞数为siControl H460/ER的69%(P<0.05)。以上结果说明,靶向IGF-1R基因沉默后,EGFR野生型NSCLC细胞H460/ER的侵袭和转移能力减弱；(3) Western Blot结果显示,靶向IGF-1R基因沉默后,H460/ER细胞中间质性标志物Vimentin及Snail蛋白表达量均显著下降(P<0.05),上皮性标志物E-Cadherin蛋白表达量明显升高(P<0.05)。结论本研究发现：沉默IGF-1R表达可抑制其下游PI3K/AKT和ERK/MAPK信号通路的传导,同时逆转细胞EMT及H460/ER细胞对EGFR-TKIs的获得性耐药,说明：IGF-1R活化可能在EGFR野生型NSCLC细胞EGFR-TKIs获得性耐药中起重要作用,且EMT很可能是IGF-1R介导EGFR野生型NSCLC细胞获得性耐药的分子学机制。