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毛囊是一种微型器官,由外根鞘、内根鞘和毛干组成,始终处于生长期、退行期和休止期的周期性循环中。皮内脂肪组织是毛囊的一个重要的宏观环境,研究发现皮下脂肪组织与毛囊形成和功能密切相关。事实上,许多研究表明毛囊的再生循环由干细胞诱导,与脂肪组织和脂肪细胞谱系细胞密切相关。旁分泌机制被认为是目前脂肪间充质干细胞(adipose mesenchymal stem cells,ADSCs)促进毛囊组织再生的关键,其机制认为干细胞分泌的生长因子、细胞因子和趋化因子影响多种细胞的存活、增殖、迁移和基因表达,且作用效果有组织特异性。在影响ADSCs功能的众多因素中,周围环境中的氧气浓度特别是低氧环境发挥了重要作用。低氧促进ADSCs的增殖和自我更新能力显著提高,发挥再生潜力。同时可以通过增强某些生长因子的分泌来增强ADSCs的旁分泌作用。本研究选用绒山羊g ADSCs作为研究对象,以去铁胺(Deferoxamine,DFO)作为低氧模拟物培养ADSCs,模拟体内的低氧环境,确定低氧对ADSCs生长、增殖和旁分泌的影响。然后通过条件培养基培养毛囊干细胞(hair follicle stem cells,g HFSCs),检测g HFSCs生长増殖能力的变化,确定g ADSCs的旁分泌功能对g HFSCs的影响。最后对g HFSCs生长的相关信号通路进行分析,以探究g ADSCs在毛囊发育中所起的作用,进一步了解绒山羊的毛囊发育特点和分子调控机制,为深入了解绒山羊绒毛生长机理提供实验依据。一、低氧模拟物去铁胺对g ADSCs生长、增殖和旁分泌的影响本研究通过CCK-8活性法对DFO的处理浓度及处理时间进行筛选,分别配置25、50、100、200μmol/L浓度的DFO溶液,分别处理24h、48h、72h。结果表明DFO的处理浓度为25μmol/L、时间为48h时细胞活性最高。对25μmol/LDFO处理48h的ADSCs进行细胞计数法、CCK-8活性检测、细胞周期和凋亡检测。结果表明,与未经过药物处理的对照组细胞相比,25μmol/LDFO处理组G0/G1期细胞显著减少(P<0.05),S期细胞差异不显著(P>0.05),M期细胞显著增多(P<0.05),药物处理将细胞周期阻遏在M期,细胞凋亡数目显著减少(P<0.01)。ELISA定量检测DFO处理g ADSCs前后毛囊相关因子IGF-1、VEGF、b FGF和PDGF的含量变化,与对照g ADSCs相比,25μmol/LDFO处理g ADSCs48h上清中,IGF-1、PDGF含量增多,但是差异不显著(P>0.05)。VEGF、b FGF含量增多,且差异极显著(P<0.01)。检测结果表明,低氧模拟物DFO能显著增强g ADSCs的生长、增殖,对其旁分泌功能有显著的促进作用。二、ADSCs条件培养基对g HFSCs活性、细胞周期、凋亡和相关基因表达的影响本研究分别采用未经DFO处理和DFO处理48h后提取的ADSCs条件培养基对g HFSCs进行培养,然后进行细胞计数法、CCK-8活性检测、细胞周期和凋亡检测。结果表明DFO培养ADSCs 48h后提取的条件培养基培养的g HFSCs活性增强,与未经过条件培养基培养的对照组细胞相比,条件培养基培养的g HFSCs G0/G1期细胞减少,M期细胞增多,但差异不显著(P>0.05),S期细胞增多,差异显著(P<0.05)。而经过DFO处理后的条件培养基培养的g HFSCsG0/G1期细胞显著减少(P<0.05),S期和M期细胞显著增多(P<0.05),条件培养基处理将细胞阻断在S期和M期,细胞凋亡数目显著减少(P<0.01)。以实时定量PCR检测g HFSCs经过条件培养基处理前后HIF-1、VEFG和β-catenin的含量变化,结果与未经过处理、正常培养的细胞相比,条件培养基处理后的细胞中,HIF-1、VEGF和β-catenin基因转录水平均升高,且差异极显著(P<0.01)。检测结果表明,g ADSCs在毛囊发育中起重要作用,而这种效应可以由低氧效果来增强。三、低氧模拟物DFO培养g ADSCs间接促进g HFSCs生长的分子机制本研究对DFO处理48h的g ADSCs HIF-1、VEFG和β-catenin含量变化进行实时定量PCR和蛋白免疫印迹检测。结果表明:与未经过DFO处理,正常培养的细胞相比,DFO低氧模拟物处理后的细胞中,HIF-1、VEGF和β-catenin基因转录水平均升高,且差异极显著(P<0.01)。Western blot检测结果显示HIF-1、VEFG和β-catenin蛋白含量升高。Western blot检测条件培养基培养的g HFSCs中ERK、Akt信号通路,结果表明ADSCs也可以通过在毛囊中激活增殖相关信号Akt和ERK。综上研究得出:经过低氧处理后的g ADSCs增殖活性显著增强,旁分泌作用更加突出,条件培养基可以刺激毛发生长,这种效应可以由缺氧增强。ADSCs可以通过在g HFSCs中激活增殖相关信号Akt和ERK,促进毛囊再生。