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在所有己被克隆的耳聋基因中,DFNA5(Deafness, Autosomal Dominant Nonsyndromic Sensorineural5)是为数不多的目前为止其生物学功能及致聋机制仍不清楚的基因之一。1995年DFNA5被定位于7号染色体15区7p15,是第五个被定位的常染色体显性遗传性耳聋位点。1998年DFNA5基因被克隆,突变位点也被找到。到目前为止,已有多个DFNA5基因的突变被发现能够引起耳聋,尽管这些位点在基因组水平都不一样,但所有引起耳聋的DFNA5基因突变都在mRNA水平使第8外显子漏读从而造成开放阅读框移框,在继续翻译41个本来并不存在的氨基酸后提前终止现在一般认为引起耳聋的DFNA5基因突变是一个功能获得性(gain of function)突变,可能与第8外显子漏读引起的错误翻译的41个氨基酸有关,理由如下：1)引起耳聋的DFNA5突变都是显性突变；2)耳聋相关的突变型DFNA5转染体外培养的哺乳动物细胞能够引起细胞死亡的增加,转化酵母细胞则引起细胞周期停滞；3)DFNA5基因第5外显子的一个突变也造成开放阅读框提前终止,但并不引起耳聋。为了在小鼠中模拟人DFNA5耳聋突变,Van Laer L及同事利用同源重组敲除小鼠DFNA5第8外显子,造成开放阅读框移框从而在继续翻译43个原本不存在的氨基酸后提前终止翻译(小鼠DFNA5突变错误翻译的43个氨基酸与人DFNA5耳聋突变错误翻译的41个氨基酸没有同源性)。ABR检测结果显示该小鼠并没有耳聋表型。这也提示我们人DFNA5基因第8外显子漏读引起的错误翻译的41个氨基酸可能对耳聋的发生很重要。本论文在细胞水平对DFNA5蛋白的生物学功能进行研究,并对DFNA5突变的致聋机制进行初步探讨。本文第一部分主要对DFNA5生物学功能进行了研究。我们利用分子克隆方法构建了细胞转染、酵母双杂交、GST-pull down等表达载体。DFNA5在COS7细胞的亚细胞定位表明,野生型DFNA5定位在细胞质中,但是将引起耳聋的DFNA5突变型转染入细胞中后,贴壁细胞变少,且蛋白在细胞质中定位不均匀,聚集成团。我们用酵母双杂交、GST-pul、IP方法试图鉴定DFNA5相互作用蛋白。遗憾的是,由于细胞毒性及蛋白容易失活等原因,目前为止没有得到作用蛋白。Hermann Lage等将DFNA5稳转入MeWo ETO1细胞系中发现,转染有DFNA5的细胞系与对照组相比依托泊苷敏感性降低30-35%。他们利用合成荧光探针DEVD-AFC多肽检测caspase3活性,发现DFNA5急转细胞系会使caspase3介导的细胞凋亡增加。在本文第二部分中,我们通过western blot等实验方法进一步检测了DFNA5寸细胞死亡的调控。同时,我们利用高通量测序的方法,筛选DFNA5下游调控基因,以进一步了解DFNA5突变影响细胞凋亡的机制。我们的工作为深入认识DFNA5的生物学功能及突变致聋机制奠定了良好的基础。