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目的：观察慢性吗啡耐受大鼠鞘内注射慢病毒载体介导PKCγ短发夹RNA (lentiviral vector-mediated short hairpin RNA of PKCγ,LV-shPKCy)后吗啡镇痛效应的变化,检测其对脊髓PKCγmRNA及蛋白质表达的影响,应用蛋白质组学筛选吗啡耐受大鼠脊髓与PKCy功能相关蛋白质,为防治吗啡耐受提供潜在的分子靶点及理论探索。方法：1.48只SD雄性大鼠,体重280-320g,改良Yaksh法鞘内置管后随机分为4组：Ⅰ生理盐水组(NS组,n=12)、Ⅱ吗啡耐受组(MT组,n=12)、Ⅲ空白载体组(MT+LV-GFP, n=12)和ⅣPKCγ干扰组(MT+LV-shPKCy, n=12)。Ⅰ组连续6d每日两次鞘内注射生理盐水20μl,Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组连续6d每日两次鞘内注射10μg吗啡,建立慢性吗啡耐受模型。第7dⅢ、Ⅳ组分别鞘内注射表达绿色荧光蛋白的慢病毒空白载体(LV-GFP)或LV-shPKCγ。每只大鼠于术前测定基础痛阈,术后每3d鞘内注射吗啡30min后测定辐射热痛阈及机械痛阈。吗啡注射第1、7和第13d,从注射前60min开始连续6h测定每60min的热痛阈变化。2.48只SD雄性大鼠,改良Yaksh法鞘内置管成功后随机分为4组：Ⅰ生理盐水组(n＝6)、Ⅱ吗啡耐受组(n=24)、Ⅲ空白载体组(n=9)和ⅣPKCγ干扰组(n=9)。Ⅰ组连续6d每日两次鞘内注射生理盐水20μl。Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组连续6d每日两次鞘内注射10μg吗啡,建立慢性吗啡耐受模型。第7dⅢ、Ⅳ组分别鞘内注射LV-GFP或LV-shPKCγ。36只大鼠断头处死后取脊髓腰膨大行RT-PCR及western blot检查：Ⅰ组、Ⅲ组和Ⅳ组于第14天取6只大鼠脊髓,吗啡耐受组分别于吗啡给药前1天、给药第1天、第7天和第14天各取6只大鼠脊髓行分子生物学检测。第14天,Ⅲ组和Ⅳ组各取3只大鼠多聚甲醛灌注后选脊髓行冰冻切片检查。3.42只SD雄性大鼠,24只行蛋白质组学及相关分析,18只行免疫组化检验。24只大鼠按上述方法建立慢性吗啡耐受模型。第7天将吗啡耐受大鼠随机分为两组：空白载体对照组(control组,n=12)及PKCyRNA干扰组(LV-shPKCγ组,n=12),分别鞘内注射LV-GFP或LV-shPKCγ。吗啡注射前2天开始每3天测定热痛阈变化。第14天取大鼠脊髓腰膨大组织提取蛋白质,经双向凝胶电泳及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析差异蛋白,部分典型差异蛋白使用western blot检验。免疫组化大鼠随机分为三组：Ⅰ对照组(n=6),Ⅱ吗啡耐受+空白载体组(n=6),Ⅲ吗啡耐受+PKCγRNA干扰组。Ⅰ组连续7天鞘内注射20μl生理盐水。Ⅱ、Ⅲ组按照前述方法构建慢性吗啡耐受模型并在第7天分别鞘内注入LV-GFP或LV-shPKCγ。第14天取大鼠脊髓腰膨大行免疫组化检测fascin表达变化。结果：1.吗啡注射30min后痛阂变化：生理盐水组大鼠机械痛阈及热痛阈较基础值明显上升(P<0.05),吗啡注射后不同天数痛阈差异无统计学意义(P>0.0.5)；Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组大鼠第1、4天吗啡注射后痛阈较基础值明显升高(P<0.05),第7天无明显变化(P>0.0.5)；第10、13天,吗啡注射后Ⅱ、Ⅲ组大鼠痛阈无明显变化,Ⅳ组大鼠痛阈升高；第1天Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组痛阈值与生理盐水组相应值差异无统计学意义(P<0.05),其余时间点有差异(P<0.05)。吗啡注射6小时内热痛阈变化：第1天各组大鼠注射吗啡30min后观察到的镇痛效应最强,其时间依赖性的减弱但6小时后仍然有镇痛效果(P<0.05),组间差异无统计学意义(P>0.0.5)；第7、13天,生理盐水组大鼠吗啡注射后镇痛峰效应与第1天差异无统计学意义(P>0.0.5),镇痛持续时间都大于6小时；第7天,Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组大鼠热痛阈与基础值无差异(P>0.0.5),与生理盐水组相应值差异有统计学意义(P<0.05)；第13天,Ⅱ和Ⅲ组大鼠热痛阈与基础值无差异(P>0.0.5),Ⅳ组大鼠吗啡注射后30min观察到最强镇痛效应,持续6小时后仍有镇痛效果(P<0.05),各组大鼠痛阈值与生理盐水组相应值差异有统计学意义(P<0.05)。各组大鼠吗啡注射30min后热痛阈值与机械痛阈值直线相关(r=0.972,r2=0.944,P<0.05)；第Ⅳ组大鼠吗啡注射6小时内热痛阈变化第1天及第13天对应值之间直线相关(r=0.937,r2=0.878,P<0.05)。2.第14天,空白载体组及PKCγ干扰组大鼠脊髓切片可见大量绿色荧光。Ⅱ组大鼠吗啡注射后第1天PKCymRNA表达水平与术前基础值差异无统计学意义(P>0.05),第7天及第14天表达水平较基础值升高；吗啡注射后第1天PKCγ蛋白质表达无明显变化,第7天及第14天表达较基础值升高(P<0.05)。第14天吗啡耐受组大鼠脊髓PKCγ表达较盐水对照组明显升高(P<0.05); LV-shPKCγ注射下调吗啡耐受大鼠脊髓PKCγ表达水平(P<0.05),LV-GFP则否；Ⅱ组、Ⅲ组结果差异无统计学意义(P>0.05)。第14天各组大鼠脊髓MOR表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。3.吗啡慢性处理建立稳定的吗啡镇痛耐受,LV-shPKCγ注射逆转吗啡耐受。经PDQuest软件分析,空白载体对照组及LV-shPKCγ干扰组双向凝胶电泳分别可检测到大约1100个染色清楚的蛋白质点,大多数蛋白质分布于pH5至pH8范围内。经成组对比发现共计有25个明显差异表达的蛋白质点。经质谱分析鉴定为13种蛋白质。胶质纤维酸性蛋白、聚束蛋白(fascin)和胶质细胞源型神经营养因子使用western blot法验证,结果与蛋白质组学分析结果一致。吗啡处理使大鼠脊髓聚束蛋白表达上调,Ⅱ、Ⅲ组大鼠脊髓聚束蛋白染色明显较Ⅰ组深,阳性细胞数目多。LV-shPKCγ鞘内注射逆转吗啡耐受后,Ⅲ组大鼠脊髓聚束蛋白染色较Ⅱ组大鼠减弱。结论：1.吗啡慢性处理导致大鼠时间依赖性的形成镇痛耐受,吗啡耐受大鼠吗啡镇痛峰效应及持续时间都发生改变,LV-shPKCγ鞘内注射逆转镇痛耐受。2.吗啡慢性处理导致大鼠脊髓PKCγ时间依赖性升高,LV-shPKCγ鞘内注射逆转吗啡耐受大鼠PKCy表达上调,LV-GFP则否；慢性吗啡耐受大鼠脊髓MOR表达数量不受PKCγ调节。3.脊髓胶质纤维酸性蛋白、聚束蛋白及胶质细胞源型神经营养因子等蛋白质参与PKCγ基因调控慢性吗啡耐受的维持,是预防及治疗吗啡耐受的潜在分子靶点。