【摘 要】
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该研究采用重组DNA技术构建人GDNF表达质粒,在大肠杆菌及昆虫细胞中实现人GDNF的高效表达,并通过亲和层析技术纯化重组蛋白;在此基础上,进行了人GDNF结构与功能关系的研究,并
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该研究采用重组DNA技术构建人GDNF表达质粒,在大肠杆菌及昆虫细胞中实现人GDNF的高效表达,并通过亲和层析技术纯化重组蛋白;在此基础上,进行了人GDNF结构与功能关系的研究,并构建、表达获得新型ACTH(4-10)-GDNF融合蛋白;观察重组人GDNF对体外原代培养脊髓神经元的影响,并研究外源性GDNF对坐骨神经损伤后脊髓神经元的保护作用及对周期神经再生的作有.该研究结果如下:1.从人胎脑组织中提取总RNA,以RT-PCR方法获取编码GDNF成熟蛋白的cDNA.将人GDNF cDNA插入含T7启动子的质粒pET-28a(+),构建表达质粒pET-GDNF,转化大肠杆菌获得表达菌株BLGDNF,经诱导表达的GDNF形成包含体.2.应用昆虫杆状病毒表达系统(BES)在昆虫细胞Tn-5Bl-4中高效表达了人GDNF,PAGE分析表达量占细胞可溶性蛋白质的30﹪左右,表达产物经亲和层析纯化后纯度达80﹪以上.3.根据大鼠GDNF晶体结构结果,用PCR方法改造人GDNF编码基因,在大肠杆菌中表达并纯化获得了一系列人GDNF片段缺失及插入突变体,通过对脊髓神经元存活率的测定来观察结构改造对人GDNF神经营养活性的影响.4.通过PCR方法构建了促肾上腺皮质激素4-10(ACTH(4-10)与GDNF的融合基因,并将它重组克隆到了表达载体pET-28a(+)中,构建表达质粒pET-ACTH(4-10)-GDNF,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导可高效表达ACTH(4-10)-GDNF融合蛋白.5.观察GDNF对体外培养各个时期的脊髓神经元的作用.6.采用硅管套接大鼠切断的坐骨神经模型,局部给予GDNF,应用尼氏染色、酶组织化学染色方法观察到外源性GDNF能减少脊髓修复侧前角运动神经元死亡的数目,降低脊髓前角运动神经元及脊髓神经节感觉神经元中胆碱酯酶(CHE)及酸性磷酸酶(ACP)变化的幅度.
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