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口腔鳞状细胞癌(OSCC)是头颈部最常见的恶性上皮肿瘤，主要发病机制是机体免疫功能异常致使肿瘤免疫逃逸，其中树突状细胞(DC)功能异常是OSCC免疫逃逸的主要机制。我们提出假设:VEGF可趋化前体DC至肿瘤癌灶组织通过JAK/STAT3诱导OSCC患者DC异常分化、功能异常致使免疫抑制发生。 1、口腔鳞癌中前体DC异常分化为具有免疫抑制功能的髓样起源抑制细胞（如SC） DC分化的三个阶段为:前体DC、未成熟DC、成熟DC。骨髓中前体DC为一群异质性细胞，前体DC及未成熟DC在多种因子的作用下离开骨髓进入外周循环，并进入外周组织发挥免疫监视起“哨兵”作用。居于组织中的DC为未成熟DC，他们可感受细菌、病毒及各种危险刺激信号后获取抗原并活化，上调趋化因子受体并迁移至淋巴组织，高表达共刺激分子及分泌大量细胞因子将抗原递呈给T细胞介导T细胞活化，发挥其免疫功能。正常生理条件下，DC参与了中枢及外周T细胞免疫耐受。 大量数据证实免疫系统对于肿瘤的发生及发展意义重大。大量研究证明荷瘤鼠及多种类型的肿瘤患者体内循环DC降低，且肿瘤部位未成熟DC大大增加，功能异常，不能有效递呈抗原激活T细胞。研究也证实肿瘤患者中异常的髓系细胞分化是DC异常的主要机制。 DC功能异常是肿瘤逃避免疫监视的主要机制。肿瘤细胞分泌的多种可溶性因子组成了肿瘤免疫抑制的微环境，可影响骨髓及脾脏免疫细胞的分化。VEGF为肿瘤细胞及血管内皮细胞分泌的可溶性因子，其不但通过促进内皮细胞生成血管，且其具有免疫抑制功能。肿瘤释放的可溶性因子可使MDSC增加，增加的MDSC会促进血管形成及肿瘤转移。而在口腔鳞癌肿瘤患者中，髓样细胞的分化是否脱离了其正常分化发育途径，即并未分化发育为具有免疫功能的DC，而是发育分化为病理性的具有免疫抑制功能的MDSC? 为了探索OSCC患者外周血中DC分化是否出现异常，本研究获取了47例口腔鳞癌患者的外周血单个核细胞，利用流式细胞术检测了表达CD1c的髓样DC(mDC)、表达CD85g的浆细胞样(pDC)及CD33+CD14+HLA-DRlow/-的具有免疫抑制功能的髓样起源抑制细胞(MDSC)比例，并评价了患者的CD4+辅助性T细胞、CD8+胞毒性T细胞以及CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)比例。研究发现，OSCC患者外周血PBMC中mDC及pDC比例较健康人显著降低(P＜0.0001)而具有免疫抑制功能的MDSC比例显著升高(P＜0.0001);具有免疫抑制功能的Treg细胞及抑制性CD8+T细胞比例显著升高(P＜0.0001，P＜0.05)，而CD4+辅助性T细胞显著性降低(P＜0.005)。由此可以推断，口腔鳞癌患者的外周处于免疫抑制状态，且DC的比例及MDSC的比例异常表明DC分化出现异常。而我们前期的研究发现，口腔鳞癌患者外周血内VEGF显著升高，且与DC数目及比例呈负相关，体外实验也显示口腔鳞癌肿瘤细胞分泌的VEGF抑制了DC成熟，但是关于VEGF是否参与了DC分化的研究还未有报道。为了确定口腔鳞癌肿瘤微环境内VEGF是否参与了DC的异常分化，我们将健康人外周血单核细胞与高表达VEGF及添加VEGF的单抗(Avastin Beva，Ava)的口腔鳞癌细胞系HSC-3共培养，发现高表达VEGF的口腔鳞癌细胞促进了MDSC形成，用Avastin Beva拮抗VEGF表达后MDSC细胞比例降低。由此可以推断口腔鳞癌微环境内VEGF参与了前体DC分化，使其分户为具有免疫抑制功能的MDSC。OSCC患者外周血中髓样细胞的分化出现异常，具有免疫功能的DC数目降低，而与DC共起源于髓样祖细胞的MDSC细胞比例却大量增加，且机体内具有免疫抑制功能的Treg细胞以及抑制性CD8+T细胞也显著增加。我们推测:口腔鳞癌患者外周血内前体DC分化异常。 但肿瘤组织局部DC数目及状态的如何？研究发现肿瘤组织内浸润有大量未成熟DC，且肿瘤癌巢内DC为未成熟的，而在间质组织内DC为相对成熟的。而肿瘤细胞分泌的VEGF会使癌灶内浓度显著高于间质内浓度，那么在口腔鳞癌的癌灶内，前体DC在肿瘤不同部位浸润如何？高表达VEGF口腔鳞癌细胞是否趋化了前体DC至癌灶，并参与肿瘤的进程。研究发现:OSCC癌灶组织内VEGF、CD14、MCP-1的表达显著高于对应的癌旁组织（P＜0.05），且VEGF的表达与MCP的表达呈正相关（P=0.00005）。在蛋白水平，我们获取了79例OSCC患者的组织，利用免疫组化技术分析癌旁正常上皮、癌旁异常增生上皮及OSCC癌灶（间质及癌巢）不同区域内VEGF的表达、表达CD14的前体DC以及表达CD208的成熟DC的浸润状况。研究发现:OSCC患者癌旁异常增生组织内VEGF的表达及表达CD14和CD208细胞的浸润数目显著低于癌灶组织(P＜0.0001)，且异常增生组织内VEGF、CD14和CD208的表达显著高于癌旁正常上皮组织(P＜0.0001);这些结果提示，口腔鳞癌中VEGF能够趋化前体DC至肿瘤区，并参与了肿瘤进程。 2、口腔鳞癌中VEGF趋化前体DC至肿瘤区参与肿瘤进程 研究发现多种肿瘤组织内有大量未成熟DC浸润，推测肿瘤细胞分泌的可溶性因子促进了前体DC迁移至肿瘤发生部位。在多种炎症环境下，单核细胞具有分化的多潜能性，可分化为DC，巨噬细胞，神经胶质细胞及其他类型的细胞。单核细胞可被募集到肿瘤部位，发挥抑制肿瘤特异性免疫反应的作用。 为了探明癌灶组织内高浓度的VEGF是否趋化外周血内前体DC至肿瘤区，我们获取了小鼠骨髓细胞，我们用低浓度的VEGF预处理前体DC以模拟荷瘤者外周血中前体DC，再用含高浓度VEGF的口腔鳞癌细胞株培养上清模拟肿瘤微环境进行Transwell实验，观察高浓度的肿瘤微环境对前体DC趋化的影响并观察其分化。研究发现OSCC微环境内高浓度的VEGF可趋化前体DC至肿瘤微环境内;在DC分化早期即第2及4天，OSCC微环境对低浓度VEGF预处理的前体DC趋化能力强，而在DC分化后期即第6及8天对未处理的前体DC趋化能力强。由此我们得出证实:VEGF促进了前体DC迁移至口腔鳞癌微环境内。 3、口腔鳞癌中VEGF可通过JAK/STAT3通路调控前体DC分化 DC功能异常是系统性的（包括在外周血及肿瘤组织），其异常源于肿瘤分泌的可溶性因子。 STAT3活化可通过抑制多种促炎因子及趋化因子抑制DC活化。体外实验证实肿瘤中抑制DC祖细胞STAT3活化减少了未成熟DC数目，而成熟DC数目会增加。由此可以推测:抑制肿瘤患者前体DC内STAT3活化可使DC分化途径正常使其功能恢复。STAT3信号对于DC分化及成熟具有重要作用。肿瘤微环境内募集了大量具有免疫抑制的髓样细胞，形成了重要的免疫抑制细胞，其中这些髓样细胞内STAT3处于活化状态。 口腔鳞癌中VEGF通过何种机制抑制前体DC分化？为了探明OSCC内VEGF是否通过JAK/STAT3通路改变了DC的正常分化途径。首先，我们获取了37例OSCC患者癌灶组织以及对应的癌旁组织，在基因水平分析VEGF、MCP-1以及STAT3表达，并分析三者之间的相关性。研究发现:VEGF与MCP1表达呈正相关(P＜0.001)，VEGF表达与STAT3表达呈正相关(P＜0.001)，MCP-1与STAT3表达呈正相关(P＜0.001)。在蛋白水平，我们获取79例口腔鳞癌患者肿瘤组织，利用免疫组化技术分析癌旁正常上皮、癌旁异常增生上皮及OSCC癌灶（间质及癌巢）内STAT3以及p-STAT3的表达。研究发现OSCC癌患者癌旁异常增生组织内STAT3及p-STAT3表达显著低于癌灶组织(P＜0.001)，但显著高于癌旁正常上皮组织（P＜0.001）;我们分析了STAT3及p-STAT3表达与临床病理参数的相关性，研究发现:OSCC癌灶组织内，无论是癌巢还是间质组织内STAT3表达与患者的年龄、性别、吸烟状况、病理学分级（分化）、TNM临床分期、炎性细胞浸润以及是否存在淋巴结转移都无相关性（P＞0.05）。进一步，我们分析了OSCC癌灶组织的癌巢内、间质内以及OSCC癌旁异常增生组织内VEGF表达与癌巢、间质以及异常增生组织内p-STAT3表达之间的相关性，研究发现，癌灶癌巢组织内的VEGF表达与癌巢及间质内p-STAT3的表达有显著相关性(P=0.02，P=0.03)。但OSCC肿瘤组织内CD14+的pre-DC内STAT3是否表达，且是否活化？我们获取OSCC新鲜组织，经冰冻切片后进行激光共聚焦实验，我们发现:肿瘤组织内VEGF高表达，且CD14+细胞内STAT3以及p-STAT3表达。由此我们推测，OSCC肿瘤细胞分泌的VEGF促进了OSCC肿瘤细胞STAT3的活化，且使间质内前体DC内STAT3异常活化，进而使前体DC分化异常，造成了OSCC肿瘤免疫抑制的发生。并证实OSCC内VEGF可通过JAK/STAT3通路调控前体DC异常分化。 综上所述，本研究①首次发现高表达VEGF的OSCC肿瘤中前体DC异常分化为具有免疫抑制功能的MDSC而非具有免疫功能的DC;②首次发现癌灶中VEGF、CD14及p-STAT3表达与肿瘤进程有关;③在口腔鳞癌中发现OSCC肿瘤细胞分泌的VEGF也可趋化前体DC至癌灶并确认可通过JAK/STAT3通路异常活化调控DC异常分化;④首次发现OSCC患者癌巢内间质内STAT3活化与肿瘤浸润的免疫细胞的关系。