论文部分内容阅读
背景和目的侵袭性肺曲霉病是烟曲霉菌侵入免疫受损宿主所导致的一种严重感染性疾病,以曲霉菌丝侵袭血管为特征。肺微血管内皮细胞(HPMVECs)可能在其病理过程中发挥重要作用。本课题拟构建HPMVECs烟曲霉感染模型深入探讨烟曲霉与肺微血管内皮细胞的相互作用及其机制。方法作人肺微血管内皮细胞与烟曲霉共培养,构建HPMVECs烟曲霉感染模型,观察HPMVECs形态、细胞活力等变化;采用激光共聚焦显微镜技术观察HPMVECs对烟曲霉的作用;采用流式细胞技术、激光共聚焦显微镜等观察烟曲霉对HPMVECs细胞骨架肌动蛋白的影响,通过细胞跨膜电阻的检测研究烟曲霉对HPMVECs通透性的影响,并应用相应的抑制剂等探讨MAPK、ROCK、PKC等通路的作用;从蛋白质和mRNA水平观察烟曲霉对HPMVECs分泌功能的影响,并通过使用MAPK抑制剂、Western blot等手段探讨MAPK信号通路的作用及其机制;最后,我们从蛋白质和mRNA水平探讨了具有抗炎特性的水飞蓟宾在此模型中的作用。结果成功构建烟曲霉感染HPMVECs模型和小鼠巨噬细胞J744模型,观察到烟曲霉减少人肺微血管内皮细胞的数量、增大细胞连接的缝隙和降低细胞活力,观察到巨噬细胞对烟曲霉具吞噬作用,并未观察到HPMVECs吞噬烟曲霉,观察到烟曲霉导致HPMVECs形态的变化以及细胞内肌动蛋白的改变,增加HPMVECs的通透性,SB203580(p38抑制剂)、Y27632(ROCK抑制剂)、LY317615(PKC抑制剂)不同程度地抑制上述改变,烟曲霉诱导HPMVECs分泌多种细胞因子(IL-6、ICAM-1、IL-1β、E-selectin),呈时间和剂量依赖,SB203580抑制烟曲霉诱导的细胞因子的分泌,且观察到p38的活化程度增高,水飞蓟宾抑制烟曲霉诱导的细胞因子的分泌,导致p38活化程度降低。结论烟曲霉对HPMVECs具毒性作用;HPMVECs无吞噬烟曲霉的作用;烟曲霉增加HPMVECs的通透性,改变细胞骨架,受p38 MAPK、ROCK、PKC信号通路的介导;烟曲霉促进HPMVECs分泌多种细胞因子,受p38 MAPK信号通路的介导,水飞蓟宾具抑制作用。本课题通过探讨烟曲霉与肺微血管内皮细胞的相互作用有望为IPA发病机制的研究和治疗新药的研发提供新的有价值的线索。