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颌面部骨缺损是口腔领域的常见病，严重影响患者的生活质量。但是目前骨缺损的治疗方法均存在着早期骨机械性能不足的缺点，新生的骨组织都需要经过一段时间的改建才能在机械性能上达到正常行使功能的要求。
既往的研究已经发现，适当的应力刺激可以促进骨组织的生长，加速骨缺损的愈合。在微观领域，同样存在这种现象：成骨细胞在受到流体剪切力作用后，其增殖周期发生变化、碱性磷酸酶水平升高、成骨活性增强。
已有的研究表明，细胞骨架在细胞感受应力的过程中起了重要的作用。而当细胞受到应力刺激后，其细胞骨架又会发生相应的改建，这有可能影响了力一化学信号的转换过程，并导致细胞的生物力学特性发生改变。因此，要深入地研究骨组织的生物力学特性，进一步发挥应力对骨生长的促进作用，就必须了解应力介导下细胞骨架改建的机制。但是目前为止，这一机制还不明了。
本研究以LIMK2(LIM-Kinase)为靶基因，采用RNA干扰的方法沉默LIMK2基因，从而研究LIMK2在流体剪切力介导的细胞骨架的改建中的作用。本研究分为3个部分：
实验一 siRNA及pcDNA3.0-EGFP质粒转染小鼠原代成骨细胞的转染效率比较RNA干扰是生物进化过程中抵抗病毒和转座子的一种防御反应，是一种转录后基因沉默。目前，RNA干扰技术已经在基因功能研究领域得到了广泛的应用。在RNA干扰的实验过程中，较关键的步骤就是如何制备siRNA并将之高效地导入靶细胞中。目前，较为常用的手段有两种，分为体外制备法和体内表达法。前者是在体外合成RNA，再导入细胞内；后者则使用能在体内表达RNA的载体作为媒介，将载体导入细胞后，在细胞内合成RNA。这两种方法各有其优缺点。体外合成的RNA转染效率较高，但是作用时间较短，仅仅是瞬时转染，而且价格较为昂贵；而后一种方法需要转染的质粒片段大，转染较为困难。
本实验拟使用脂质体LipofectamineM2000分别介导含有FAM标记的siRNA和携带EGFP基因的质粒转染原代培养的小鼠成骨细胞，并通过不同实验条件的组合，筛选其中最理想的转染条件。
方法：分别使用化学合成的siRNA和可以表达EGFP的质粒转染小鼠原代成骨细胞，在荧光显微镜下观察带有荧光标记的细胞占总细胞数的量。再通过MTT法，检测不同的实验条件下转染后成骨细胞的存活率。结果：使用化学合成的siRNA转染原代培养的小鼠成骨细胞获得了较高的转染效率，其最大值达到90﹪以上，与质粒的转染效率相比有很大的提高，且其细胞毒性在可接受的范围内。结论：使用化学合成的siRNA转染原代培养的小鼠成骨细胞可以获得较高的转染效率，是一种理想的实验方法。
实验二小鼠原代成骨细胞的LIMK2基因的RNA干扰LIMK是cofilin(丝切蛋白)的调控分子，它可以磷酸化cofilin的丝氨酸-3残基使cofilin失活从而抑制后者对F-actin(聚合态肌动蛋白)的剪切作用。研究发现，过表达LIMK2可以促进细胞张力纤维的形成；抑制LIMK2的表达则可以阻断TGF-β1诱导的纤维母细胞的细胞骨架改建。这表明了LIMK2在调节多种细胞的细胞骨架改建中起重要的作用。但它是否参与了流体剪切力介导的成骨细胞的细胞骨架改建，还有待进一步研究。
本实验拟采用RNA干扰抑制原代成骨细胞中LIMK2的表达并检测其抑制效率，为进一步研究LIMK2在细胞骨架改建中的作用奠定基础。
方法：用脂质体介导化学合成的siRNA转染到原代成骨细胞中，转染后24h和48h提取细胞的总RNA和总蛋白，分别进行RT-PCR和Western-blot检测，从三条siRNA中筛选出抑制效率最高的一条。结果：化学合成的siRNA对小鼠原代成骨细胞的抑制效率最高达到了70﹪以上。结论：编号为R3的siRNA可以很好地抑制小鼠原代成骨细胞的LIMK2表达。实验三抑制LIMK2表达对流体剪切力介导的成骨细胞的细胞骨架改建的影响通过前面的研究，已经证明了siRNA可以特异性地抑制小鼠原代成骨细胞中LIMK2的表达。在此基础上，为了了解LIMK2在流体剪切力介导的成骨细胞的细胞骨架改建中的作用，本实验拟使用能特异性抑制LIMK2表达的siRNA以及不具有抑制效果的阴性对照RNA分别转染成骨细胞，并将细胞置于流体剪切力下加载，观察加载后细胞骨架的改变。
方法：将同一批细胞分为阴性对照组(加载)、RNA干扰组(加载)、阴性对照组(不予加载)和RNA干扰组(不予加载)共4组，分别编号为1、2、3、4。使用阴性对照siRNA(无特异性抑制效果)转染1组和3组的成骨细胞；使用能特异性抑制LIMK2表达的siRNA转染2组和4组的成骨细胞。转染完成后使用流体剪切力加载1、2两组，3、4组细胞不予加载。加载后在激光共聚焦显微镜下观察细胞骨架的改建情况，测量各项形态学参数。结果：与1组相比，2、3、4组的细胞在受到流体剪切力加载后细胞骨架的荧光密度较弱，分别是1组的28.9﹪、45.7﹪、33.0﹪。结论：在小鼠原代成骨细胞的LIMK2表达受到抑制以后，因流体剪切力而导致的细胞骨架的改建会被抑制。这说明了LIMK2在流体剪切力介导的细胞骨架的改建中起到了重要的作用。