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目前，已建立的小鼠ES细胞系大多来源于129、C57BL/6J和BALB/C品系的小鼠，昆明小鼠作为我国科研工作中常用的实验动物，其建系的报道较少，因此建立昆明小鼠胚胎干细胞系对我国深入而便利地开展ES细胞以及其它生命科学领域的研究具有重要意义。SC1是一种小分子化学物，可以双重抑制Ras-GAP和ERK1，维持胚胎干细胞未分化状态。另外，近几年，已有多篇关于胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ES细胞）在体外诱导条件下分化为原始生殖细胞（Primordial germ cells，PGCs），并进一步生成成熟配子的报道，但ES细胞向生殖细胞的诱导效率很低。本研究用昆明小鼠胚胎作为试验对象，比较了不同培养条件对昆明小鼠ES细胞分离培养的影响，研究了小分子化学物（Pluripotin，SC1）对昆明小鼠ES细胞未分化状态的维持作用，并用视黄酸（Retinoic acid，RA）对分离到的ES细胞向PGCs诱导分化进行了初步研究，为昆明小鼠ES细胞建系及向生殖细胞的体外分化研究提供参考。1.利用MTT法检测丝裂霉素C（10μg/mL）处理不同时间后小鼠胎儿成纤维细胞（Mouseembryonic fibroblast, MEF）活力变化情况。结果表明，以3代以内MEF制备饲养层，用浓度为10μg/mL的丝裂霉素C处理2~2.5h，MEF活力最稳定，可以维持小鼠胎儿成纤维细胞7d以上不增殖也不死亡，是制备饲养层的适宜条件。2.将见栓后3.5~4d的胚胎分别接种于密度为1×104、1×105、1×106/mL的饲养层上，比较胚胎在不同密度饲养层上贴壁、内细胞团（Inner cell mass，ICM）集落形成及ES细胞的克隆生长情况。同时，以无血清培养基为基础培养液，研究胚胎发育阶段和培养液中添加不同生长因子对昆明小鼠ES细胞增殖的影响。结果显示，胚胎在密度为1×105/mL的饲养层上，F1代和F2代ES细胞集落出现率均显著高于其他2组(P<0.05)。囊胚的F2代ES细胞克隆出现率显著高于桑葚胚(P<0.05)，培养液中同时添加干细胞因子（Stem cell factor，SCF）和胰岛素的胚胎贴壁率及F1、F2代ES细胞集落出现率显著高于其他2组(P<0.05)。对分离的ES细胞进行形态观察、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP）染色，免疫荧光染色检测小鼠ES细胞全能性特异标志物的表达，证实所分离的ES细胞符合小鼠ES的一系列特征。由此认为，发育至囊胚的胚胎在饲养层密度为1×105/mL上，培养液中同时添加胰岛素和SCF适合昆明小鼠ES细胞的分离培养。3.比较了在含血清替代品（Knockout serum replacement，KSR）的高糖DMEM培养液中（H-DMEM）分别添加SC1和白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor，LIF）对昆明小鼠ES细胞未分化状态的维持作用，并探讨了SC1在培养液中的最佳浓度。以MEF为饲养层，以含LIF的无血清胚胎干细胞培养液为对照，分别用浓度为300nM、1μM、3μM的SC1代替LIF对昆明小鼠胚胎进行分离培养。结果显示，胚胎在添加3μmSC1的培养液中ICM集落形成率显著高于对照组（P<0.05），形成的ES集落与对照组形态差异不明显，最高传至第7代，并且在无饲养层条件下可以传至第6代而保持未分化状态。不同浓度SC1培养液中，胚胎在SC1浓度为300nM组的F2代ES细胞集落出现率显著高于1μM和3μM组（P<0.05），所分离的ES细胞AKP染色呈阳性，Oct4、Nanog、Sox2的免疫荧光染色均显阳性，具有ES细胞的特点。这一结果表明无血清培养液中SC1可以替代LIF用于昆明小鼠ES细胞未分化状态的维持，并且可以在无饲养层条件下进行昆明小鼠ES细胞的培养。4.探讨了RA诱导昆明小鼠ES细胞向PGCs分化的能力及适宜浓度。采用悬滴培养法使分离到的第3代ES细胞形成类胚体（Embryonic bodys，EBs），将第3d形成的EBs，接在铺有0.1%明胶的48孔板中，5个EB/孔，分别用浓度为0.2μM、1μM、5μM的RA和不加RA的培养液进行培养。第10d免疫荧光染色的结果表明，浓度为1μM的RA诱导小鼠ES细胞分化为PGCs的效率显著高于其它组（P<0.05），SCP3和VASA的阳性率表达率分别是31.8%和30.4%，均高于其它组，表明RA可以诱导昆明小鼠ES细胞向PGCs分化，最佳浓度为1μM。