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本文以我国重要农作物害虫棉铃虫Helicoverpa armigera与其优势种幼虫内寄生蜂棉铃虫齿唇姬蜂Campoletis chlorideae为寄生体系,研究了寄生蜂C.chlorideae寄生对寄主H.armigera血淋巴免疫识别因子C-型凝集素和溶血素的调控和诱导。并对寄主棉铃虫唾液(反吐液)中新发现的免疫相关物质凝集素和溶血素进行了识别和初步鉴定。进一步,对分别来自棉铃虫血淋巴和唾液中的溶血素进行了理论特性的研究,以期为深入研究其分子结构和生理功能提供依据。主要结果如下:一、棉铃虫齿唇姬蜂寄生对棉铃虫凝集活性和C-型免疫凝集素基因转录的调控为探明内寄生蜂成功调控寄主免疫反应的分子基础。本文通过棉铃虫齿唇姬蜂和寄主棉铃虫这一寄生体系,研究寄生对寄主幼虫生长发育、血淋巴蛋白和凝集活性,以及8个C-型凝集素基因转录水平等的影响。结果表明:寄生显著抑制棉铃虫幼虫的生长发育,导致血淋巴蛋白含量显著提高,出现多条寄生特异蛋白。凝集素作为重要的体液免疫因子,在棉铃虫发育的不同时期均有表达,且随虫龄增大活性增强。寄生蜂寄生后第2 d和6 d,被寄生幼虫血淋巴凝集素活性分别是未被寄生幼虫的4和8倍。在棉铃虫不同发育期,8个C-型凝集素的表达特性存在明显差异,从末龄幼虫的取食期到游走期,凝集素基因HaCTL1、HaCTL3、HaCTL4和HaCTL5的mRNA转录水平上调,而HaCTL2和HaCTL7却出现下调。该结果表明这些凝集素基因的转录水平与昆虫的生长发育密切相关即受激素的调控。组织特异性研究表明,8个C-型凝集素主要在血细胞和脂肪体中表达,此外,在中肠、表皮、马氏管、精巢和唾腺中也有表达,但不同基因在不同组织中的表达特性存在显著差异。寄生蜂寄生对这些凝集素基因的转录水平的调控明显不同,在寄生后第4 d,8个凝集素中除HaCTL6外均被显著抑制,这表明C-型凝集素参与了寄主昆虫和寄生蜂间的免疫与免疫抑制作用。本研究提供了寄生蜂寄生对寄主免疫凝集素调控的信息,可以增强目前我们对于寄生蜂成功寄生的认识,为更好的利用寄生蜂防治棉铃虫奠定基础。二、棉铃虫齿唇姬蜂寄生诱导棉铃虫血淋巴溶血因子的高表达溶血素或溶血因子(Hemolysin,hemolytic factor)在无脊椎动物中普遍存在,因其具有溶解异物的特性而备受关注,是重要的体液免疫因子。无脊椎动物对入侵病原物的溶解是其先天免疫的一种主要形式,但目前对植食性昆虫中是否存在溶血因子尚无详细报道。为此,本文综合运用了4种溶血检测法即V底微量反应板、显微镜观察、琼脂糖平板溶血斑和分光光度法分别测试了多食性昆虫棉铃虫幼虫血淋巴对脊椎动物鸡、鸭和兔血红细胞的溶血活性,以充足的的证据表明在棉铃虫幼虫血淋巴中存在有溶血活性物质。进一步,通过硫酸铵盐析、透析初步分离出具有溶血活性的物质,表明其为蛋白质。此外,除幼虫期,在棉铃虫卵、蛹和成虫中也发现有溶血素。幼虫虫龄不同表现出明显的溶血活性差异,且幼虫取食期溶血活性明显高于蜕皮期或蜕皮初期。溶血素在棉铃虫的多个组织中均有分布,如唾腺、脂肪体、表皮、中肠和精巢,而唾腺和脂肪体的溶血活性最高。棉铃虫齿唇姬蜂寄生后第2d,被寄生棉铃虫幼虫血淋巴溶血活性比未被寄生幼虫的活性提高了3.4倍。该结果表明棉铃虫幼虫血淋巴中存在的溶血活性物质能够被寄生蜂寄生所诱导。注射大肠杆菌12和24h后,棉铃虫幼虫血淋巴溶血活性显著提高。由此推断,该溶血因子是可诱导的或是从头合成的,这意味着该溶血因子与寄主昆虫的免疫反应相关,可能通过抑制或清除入侵的病原物或寄生物来实施免疫防御。三、棉铃虫唾液(反吐液)中新凝集素和溶血素的识别与初步鉴定凝集素作为模式识别受体,在异物识别中发挥重要作用。棉铃虫血淋巴中含有至少8种凝集素,但对其唾液(口腔反吐物)是否存在识别异物的凝集素却从未涉及。本文通过v底微量反应板检测到棉铃虫唾液含有凝集活性物质。在相差显微镜下,可观察到唾液使鸡血红细胞发生明显的凝集现象。经硫酸铵盐析,35%和45%硫酸铵沉淀出的蛋白具有明显的凝集活性,表明其为蛋白质。通过糖抑制试验,发现棉铃虫唾液凝集素与血淋巴凝集素的糖结合谱存在差异,表明他们是不同的凝集素种类。此外,利用不同脊椎动物红细胞通过v底微量反应板、显微镜观测、琼脂糖平板溶血斑和分光光度法4种溶血活性检测方法,证实了棉铃虫幼虫唾液中存在溶血活性物质,它的溶血活性远高于同体积血淋巴的活性。低龄幼虫溶血活性略高于高龄幼虫。且在供试的亚洲玉米螟ostriniafurnacalis、甜菜夜蛾spodopteraexigua、二点委夜蛾proxenuslepigone、菜青虫pierisrapae等鳞翅目昆虫中普遍存在。但是,溶血活性存在差异。如二点委夜蛾溶血活性最高,棉铃虫次之,玉米螟、甜菜夜蛾和菜青虫唾液溶血活性相对最低。取食的食物对棉铃虫唾液溶血活性也产生影响,如取食人工饲料饲养的棉铃虫幼虫唾液溶血活性最高,辣椒次之,甘蓝最低。进一步,对唾液溶血素的发生来源进行了分析,中肠液溶血活性最高,唾液和前肠液溶血活性次之,而后肠液溶血活性最低;对相应组织研磨液溶血活性分析发现,唾腺研磨液溶血活性最高,前肠和中肠次之,后肠组织研磨液只有极低的溶血活性,由此判断唾腺和中肠是其可能的来源。唾液经硫酸铵盐析、透析后,同样获得了具有溶血活性的物质,表明其为蛋白质。利用不同脊椎动物红细胞进行交叉吸附试验,发现它对不同红细胞种类的溶血活性以兔红细胞最强,且红细胞吸附后的唾液溶血活性被明显抑制。进一步,用制备的红细胞膜吸附处理唾液样品,通过sds-page电泳,筛选具有与膜结合并具有溶血活性的蛋白,共获得分子量48kda、28kda和23kda的差异蛋白条带。利用esi质谱鉴定,从中筛选出革兰氏阴性菌结合蛋白和肽聚糖识别蛋白,其分子量分别为42.0kda和20.1kda,等电点pi分别为5.85和5.71。除此之外,还有一些酶类。由此推断棉铃虫唾液中的溶血素可能与识别和溶解病原细菌有关。四、棉铃虫血淋巴溶血素的理化特性为深入研究棉铃虫血淋巴新发现的免疫因子溶血素的分子结构和生理功能,明确其分离、纯化的理化条件非常重要。本文分别就温度、ph、edta和金属离子对该溶血素的影响及其糖结合特性进行了研究。结果表明:棉铃虫血淋巴溶血素热稳定性较差,在50℃时,溶血活性显著下降,60℃时,溶血活性即完全丧失,属热不稳定型。血淋巴溶血素反应浓度与溶血活性并不成正比,8倍稀释液的溶血活性反高于4倍稀释液,但随稀释倍数增加,32倍及以上稀释倍数的血淋巴无溶血活性。血淋巴与红细胞在反应前60 min内,溶血百分率无明显变化,反应2 h后,对红细胞溶解速度急剧加快,6 h溶血效能最大。血淋巴溶血活性的最适pH为7-8。浓度62.5、125、250和500 mM EDTA对血淋巴溶血活性具有促进作用,而金属离子Mn2+、Zn2+、Co2+和Ca2+却具有极显著的抑制作用。糖抑制试验结果表明:D-乳果糖、棉子糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖、对硝基苯-β-D-半乳糖吡喃糖苷(PNPG)和唾液酸均未对血淋巴溶血活性产生抑制作用,说明棉铃虫血淋巴溶血素与上述糖没有结合位点。五、棉铃虫唾液(反吐液)溶血素的理化特性探明棉铃虫唾液(反吐液)中溶血素的理化特性,可为深入研究棉铃虫的免疫防御机制提供依据。采用鸡血红细胞对棉铃虫唾液进行溶血活性测定,研究温度、浓度、作用时间、pH、EDTA和金属离子等理化因子对其溶血活性的影响,通过糖抑制试验分析其结合特性,并以蜜蜂蜂毒溶血肽的特性进行对比研究。结果表明:在45℃、50℃条件下,棉铃虫唾液溶血素的溶血活性升高,在60℃-100℃活性降低,但溶血活性依然可达最大溶血活性的67.5%,说明其具有一定的热稳定性。与之相比,蜂毒溶血肽热稳定性极强,在100℃下,溶血活性保持不变。唾液样品在稀释16倍时溶血活性达最高,是未经稀释原液溶血活性的1.6倍,而蜂毒样品在稀释1-32倍之间,溶血活性变化不明显。唾液溶血素与红细胞在反应5-15 min之间,对红细胞溶解速率最大。蜂毒样品在35 min-1 h和2-6 h出现两次红细胞快速溶解。唾液溶血素具有广泛的pH耐受度,在pH 2-10,溶血活性没有变化。唾液经125、250和500 mM EDTA处理后,溶血活性显著升高,而蜂毒只在500 mM EDTA下溶血活性显著提高,62.5、125、250和1000 mM EDTA下溶血活性反被显著抑制。金属离子Mn2+、Zn2+、Co2+、Ca2+和Ni2+抑制唾液溶血素活性,而K+和Mg2+对唾液溶血素活性具有促进作用。对于蜂毒,Mn2+、Zn2+、Co2+和Ni2+能够显著抑制其溶血活性。糖抑制试验结果表明,测试的D-乳果糖、PNPG、棉籽糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖和唾液酸对唾液溶血活性均没有抑制作用,但蜂毒溶血活性能够被D-乳果糖和乳糖显著抑制,由此说明棉铃虫唾液溶血素的结合特性不同于蜂毒溶血肽。