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研究背景及目的激素性股骨头坏死(steroid-induced femoral head necrosis, SFHN)是由于长期使用激素类药物,导致以股骨头血供受损,骨细胞及骨髓成份死亡,继而导致股骨头结构改变、股骨头塌陷、关节功能障碍为特征的代谢性疾病。大约75%的患者从诊断SFHN起3年内便可发生股骨头塌陷,最终超过65%的患者不得不接受髋关节置换手术,给患者家庭和社会带来了巨大经济负担。探索SFHN的发病机制,从而及时有效地干预SFHN的进展将具有极大的经济效益和社会效益。SFHN发病机制的研究,国内外均未取得突破性进展。近年来,国内外学者对SFHN的发病机制进行了深入的研究,并提出了众多学说,其中包括骨内高压学说、凝血机制改变学说、脂肪栓塞学说、骨质疏松学说、骨细胞凋亡学说、膜微粒学说等等。至今,SFHN具体的发病机制仍不清楚,尚需进一步的研究。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSC)是骨髓中一类具有多向分化潜能并在多种疾病发生发展过程中具有重要病理生理作用的细胞。体外实验发现大剂量糖皮质激素可通过糖皮质激素受体(GR)和激活蛋白-1(AP-1)途径抑制BMSC的增殖和成骨分化,相关研究也发现股骨头坏死患者转子部位成骨细胞的增殖能力下降。nicroRNA (miRNA)作为细胞内一类重要的非编码调控分子,它所介导的调控作用已经被认为是多细胞生物基因表达转录后水平的一种普遍调节方式。许多niRNA已被证明参与了骨质形成的过程,并在其中发挥关键作用。BMSC结合miRNA是研究SFHN发病机制的一个新的视角,存在为SFHN提供早期诊断与治疗的潜在价值。本课题将应用niRNA芯片筛选出调控SFHN相关的miRNA;对于我们筛选出的目标miRNA,进一步验证其功能,然后应用双荧光素酶报告基因系统、siRNA等技术探讨其调控机制,以期阐明激素性股骨头坏死的发病机制。方法1、BMSC的分离、培养与鉴定：从3例健康者和5例激素性股骨头坏死并接受外科手术治疗的患者体内取出骨髓,按照已建立的密度梯度离心法,获取BMSC,并培养传代,并对细胞表型、成骨等功能活性进行了初步的检验。2、差异性miRNA的筛选：在成骨分化过程中,对正常BMSC、激素性股骨头坏死BMSC和大剂量地塞米松刺激的BMSC提取RNA,然后通过基因芯片的方法测定miRNA表达情况,并筛选出差异性miRNA.3、差异性表达miR-23a的功能验证：将miR-23a的mimics(?)inhibitor导入正常BMSC,模拟过表达miR-23a和低表达miR-23a,然后进行成骨诱导,在3天、6天、9天和12天进行碱性磷酸酶染色、茜素红染色、Real Time PCR、western blot及ALP活性检测,进一步验证候选miR-23a对成骨作用的影响。4.miR-23a抑制BMSC成骨分化的机制：首先通过专业的靶基因预测网站,对候选miR-23a的靶基因进行初步的预测,然后通过双荧光素酶实验,验证靶基因与miR-23a的结构匹配性,最后通过siRNA干扰技术,进一步验证靶基因。最后通过通路抑制剂干扰具体的信号通路,验证miR-23a信号传导的具体通路。结果1、成功分离出BMSC,并通过流式细胞仪对其表型进行了鉴定,并通过相关染色、Real Time PCR的方式鉴定了其潜在的成骨分化能力。2、大剂量地塞米松刺激BMSC和激素性股骨头坏死B MSC中,miR-423-5p、 miR-193b*、miR-744、miR-214、miR-423-3p、miR-320a、miR-140-3p等7个miRNAs 表达下降,miR-152、miR-23a、miR-425、miR-27a、miR-221、miR-151-5p、miR-22、 miR-224*等8个miRNAs表达上调.3、选取miR-23a进行功能试验。细胞水平、蛋白水平和mRNA水平显示,miR-23a抑制成骨,结果与上述芯片结果相一致。4、通过TargetScan.miRBase等靶基因专业预测网站,预测8个候选靶基因；然后通过双荧光素酶报告实验,最终确定miR-23a靶基因为LRP5。最终确定miR23a通过Wnt通路抑制BMSC成骨分化。结论1、筛选出SFHN特异性miRNA表达谱。2.miR-23a靶基因为LRP5,通过Wnt通路抑制人BMSC成骨分化。