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木豆芪酸(CSA;3-hydroxy-4-prenyl-5-methoxystilbene-2-carboxylic acid)是非常重要的热带植物木豆叶子中的主要成分,体外研究表明木豆芪酸具有降血糖、降血脂、预防骨质疏松等功效,课题组前期研究表明木豆芪酸还具有良好的抗肿瘤活性。本文建立了一种快速、灵敏的高效液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)的方法首次检测大鼠血浆以及各个组织(大脑、心、肝、脾、肺、肾脏以及小肠)中木豆芪酸的浓度并对其药物代谢动力学和组织分布进行了研究;考察了体外人肝微粒体中与木豆芪酸代谢有关的细胞色素P450酶的亚型,以及木豆芪酸在人肝微粒体中所形成的代谢产物;考察了木豆芪酸对人肝微粒体中细胞色素P450酶的7种亚型(CYP1A2,CYP2A6,CYP2E1,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6,和CYP3A4)的抑制作用以及木豆芪酸对人原代肝细胞中细胞色素P450酶的6种亚型的诱导能力。本研究为木豆芪酸的新药研究提供了重要的研究基础,具体研究结果如下:1.建立了一种快速、灵敏的高效液相色谱-质谱联用方法测定大鼠血浆中木豆芪酸的浓度并对其药物代谢动力学进行了研究利用这种方法对木豆芪酸和异甘草素(内标)进行检测,木豆芪酸和异甘草素的保留时间分别为9.19分钟和3.50分钟,均小于10分钟。大鼠血浆中木豆芪酸样品的标准曲线从10ng/mL-6000ng/mL,且线性良好(R= 0.9967)。木豆苗酸的大鼠血浆中样品最低定量限(LLOQ)为10ng/mL。木豆芪酸的大鼠血浆样品的日内精密度范围为99.2%到103.4%,日间精密度范围为102.0%到107.5%,日内准确度范围是从1.8%-3.8%,日间准确度的范围是从2.2-6.6%。木豆芪酸大鼠血浆样品在10、100和1000 ng/mL三个浓度下的平均回收率分别为103.4±3.6%、102.7±3.0%和99.1±1.9%,内标异甘草素的回收率为95.6±5.2%。并且木豆芪酸大鼠血浆样品的短期稳定性、冻缓循环稳定性、长期稳定性以及自动进样稳定性的标准偏差均小于6.7%。以上结果均符合相关标准的要求。在大鼠血浆的药物代谢动力学实验中,每只大鼠灌胃给药2mg/kg木豆芪酸。分别在0.083、0.167、0.25、0.5、1、2、4、8小时抽取大鼠血浆样品。灌胃给药后大鼠血浆中木豆芪酸的药物表观分布容积(AUC0→∞)为343,372.89±2546.66ngmin/mL,半衰期(t1/2)为 51.40±6.54min,达峰时间(Tmax)为 10.7±0.31min,最大血药浓度(Cmax)为4500±345.83 ng/mL。从结果中我们可以看出木豆芪酸在大鼠血浆中的达峰时间小于15min说明木豆芪酸灌胃给药后可以迅速的被吸收,而木豆芪酸在大鼠血浆中的半衰期小于1小时说明木豆芪酸同样很快的被代谢。2.建立了高效液相色谱-质谱联用方法检测大鼠口服木豆芪酸后体内各组织中木豆芪酸的分布木豆芪酸各个组织匀浆液样品的范围为10-6000ng/mL,且线性良好。木豆芪酸各个组织匀浆液样品的日内精密度范围为93.5%到104.6%,日间精密度范围为93.3%到106.4%,日内准确度范围是从0.6%-6.1%,日间准确度的范围是从1.5-5.8%。所有木豆芪酸各个组织匀浆液样品的平均回收率均高于95.0±4.8%。木豆芪酸大鼠组织匀浆液样品的短期稳定性、冻缓循环稳定性、长期稳定性以及自动进样稳定性的标准偏差均小于7.5%。以上结果均符合相关标准的要求。我们在给大鼠灌胃给药2mg/mL木豆芪酸后对其在大鼠体内的组织分布进行分析,在给药后的60分钟内,木豆芪酸迅速分布至心、肺、肝、脾、肾脏和小肠中。其中小肠中木豆芪酸的浓度最高,其次是肝脏和肾脏。小肠中木豆芪酸的高浓度可能是归结为灌胃给药后药物从小肠中被吸收,其中有很大一部分木豆芪酸的残留物。而肝脏中木豆芪酸浓度较高可能是因为肝脏是木豆芪酸的主要代谢部位。肾脏中木豆芪酸的含量在一个小时内逐渐升可能是因为肾脏是木豆芪酸的主要排泄器官。然而,在实验中我们并没有在大鼠的脑部发现木豆芪酸,这可能是因为木豆芪酸不能通过血脑屏障的原因。3.确定了木豆芪酸在人肝微粒体中的代谢途径以及一相代谢产物通过将木豆芪酸与人肝微粒体以及重组人肝微粒体酶共同孵育,得到了两个羟基化代谢产物,通过对比木豆芪酸的裂解规律以及两种代谢产物的分子离子碎片,可以推断两个代谢产物的结构式为12-羟基-木豆芪酸和6-羟基木豆芪酸。实验中两种代谢产物在有NAPDH催化的情况下呈现时间依赖规律,两种代谢产物在人肝微粒体中代谢的米氏常数分别为28.8μM和23.6μM,最大反应速率分别为141.6和122.7 pmol/mg/min,表观清除率分别为4.9和5.2 μL/mg protein/min。利用重组人肝微粒体酶单独对木豆芪酸进行孵育方法与化学抑制剂方法确定了参与木豆芪酸体外代谢的主要细胞色素P450酶亚型为 CYP3A4,CYP2C9 和 CYP1A2。4.评估了木豆芪酸对人肝微粒体中细胞色素P450酶的抑制作用和人原代肝细胞中木豆芪酸对细胞色素P450酶的诱导作用采用高效液相色谱-质谱联用方法对细胞色素P450酶亚型的特异底物探针进行检测,结果表明木豆芪酸对人肝微粒体中的P450酶亚型CYP3A4和CYP2C9有一定的抑制作用,对CYP1A2,CYP2A6,CYP2C19,CYP2D6和CYP2E1不存在抑制作用,其中对P450酶亚型CYP3A4和CYP2C9的半数抑制浓度分别为28.3μM和31.3μM,对其他亚型的半数抑制浓度均大于40μM。在浓度小于30μM时木豆芪酸对人原代肝细胞中的人肝微粒体 P450 酶亚型 CYP1A2、CYP2A6、CYP2E1,CYP2C9、CYP2C19 和 CYP3A4并不能产生显著的诱导作用。本文首次对大鼠口服木豆芪酸后的药物代谢动力学以及体内分布进行了研究,并且利用人肝微粒体和重组人肝微粒体阐明了木豆芪酸的体外代谢途径以及在细胞色素P450酶中的代谢产物,研究了木豆芪酸对细胞色素P450酶的抑制和诱导作用,为木豆芪酸新药研究和临床应用提供了科学基础,并为木豆芪酸可能产生的药物-药物相互作用做出了指导。