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多发性硬化症（MS）是一种常见的中枢神经系统损伤的自身免疫性疾病,主要由髓鞘特异性自身反应性T细胞所介导。其中CD4+髓鞘特异性T细胞被认为是MS的主要介导细胞,然而,近年来发现髓鞘抗原特异性CD8+ T细胞在MS的发病中也起到重要的作用,特别是在急性脱髓鞘损伤中,其频率高于CD4+ T细胞。因此,在探讨MS发病机制中,CD8+ T细胞同样成为研究的焦点,如果能够在抑制髓鞘特异性CD4+ T细胞的同时特异性抑制髓鞘特异性CD8+ T细胞的功能,有望更有效的抑制MS的发生与发展。本室前期的研究结果显示,pMHC二聚体可作为T细胞的特异性配体有效的抑制CD8+ T细胞的功能。本研究拟构建并表达H-2Db/IgG2b二聚体,并加载MOG35-55抗原肽形成MOG35-55/H-2Db二聚体,该pMHC二聚体可作为MOG35-55特异性T细胞的配体,以应用于MS的动物模型实验性自身反应性脑脊髓炎（EAE）中,探讨可溶性pMHC二聚体诱导自身反应性T细胞耐受、阻断小鼠EAE发生的作用。论文分为2个部分,主要内容与结果如下:1.可溶性H-2Db/IgG2b二聚体的构建用RT-PCR的方法从C57BL/6（B6）小鼠淋巴细胞中扩增出H-2Dbα链的编码基因,通过酶切位点将H-2Dbα链编码基因和小鼠IgG2b Fc段编码基因连接,形成H-2Db/IgG2b重组序列,然后分别将H-2Db/IgG2b重组序列与小鼠轻链β2m序列插入昆虫杆状病毒双表达载体pFastBacTMDual的2个启动子Pp10和PpH的下游,构建获得[H-2Db/IgG2b]+pFastBacTMDual+β2m重组质粒,作为H-2Db/IgG2b二聚体的表达载体。通过PCR及限制性内切酶酶切鉴定和测序,证实了重组质粒中H-2Db/IgG2b序列及β2m编码基因与预期序列一致。2.可溶性H-2Db/IgG2b二聚体的表达、纯化与鉴定将[H-2Db/IgG2b]+pFastBacTMDual+β2m重组质粒转化大肠杆菌DH10Bac,得到重组的穿梭质粒Bacmid+[H-2Db/IgG2b]。应用脂质体转染方法将其转入昆虫细胞系Sf9中,收获上清得到成熟杆状病毒颗粒,再用此病毒颗粒大量感染Sf9细胞,收集富含H-2Db/IgG2b二聚体的病毒感染上清,经SPA亲和层析得到浓缩纯化的可溶性H-2Db/IgG2b二聚体。利用H-2Db特异性的TIB-126抗体以及抗IgG2b Fc抗体进行双抗夹心ELISA鉴定及流式检测,结果显示获得的可溶性H-2Db/IgG2b二聚体具有正确的构象,Western blotting鉴定结果显示H-2Db/IgG2b融合蛋白的分子量为61kD,与预期大小一致。