论文部分内容阅读
何首乌(Fallopia Multiflora (Thunb.))为蓼科的多年生缠绕草本植物，其块根及藤均为名贵的大宗中药材。本研究主要从细胞水平进行何首乌的染色体核型的分析；用AFLP银染技术从构建何首乌的DNA指纹图谱；用结构十分保守的18SrRNA和进化率较快的matK基因进行序列比较与变异分析，对何首乌的遗传多样性进行初步研究，分析种间差异及种质资源之间的遗传变异，何首乌良种选育及其基础理论研究打下坚实的基础；有效地研究药用植物的亲缘关系；丰富建立质量控制体系的理论依据，具有重要的理论及现实意义。本文研究结果主要如下：
1.细胞学研究表明，何首乌栽培种体细胞染色体存在有2n=22和3n=33,广东德庆栽培和江西新建栽培种体细胞染色体数目是2n=22，为二倍体(2X)，而广西靖西栽培种体细胞染色体数目是3n=33，为三倍体(3X)属首次报道。广西靖西核型公式为：K(3n)=3X=33=9m+24sm，核型应属于“2A”型。广东德庆核型公式为：K(2n)=2X=22=12m+10sm，核型应属于“2B”型。江西新建核型公式为：K(2n)=2X=22=6m+14sm+2st，核型应属于“2A”型。
2.对植物中常用的DNA提取方法CTAB常规法进行改良，用改良的方法提取何首乌的DNA，OD260/OD280在1.792～2.006之间，能完全被EcoR I和Mse I酶切消化，能获得清晰的AFLP指纹图谱，说明所提取的DNA符合进行AFLP分子标记实验的要求和一般分子生物学实验的要求。因此，本研究为从富含多糖等多种次生代谢物质的植物何首乌中分离高质量基因组DNA提供了简便实用的方法。
3.通过对AFLP的酶切体系、预扩体系和选扩体系，建立了适合何首乌的AFLP反应技术体系，结果表明，得到了清晰可读，重复性好，分辨率高的．AFLP图谱，为下一步的遗传分析奠定了基础。
4.采用AFLP-银染显色分子标记技术对144个何首乌样品的遗传亲源关系与分类进行研究。仅用3对扩增条带多、多态检出率高的3+3引物组合，获得238条清晰可辨的AFLP条带，其中多态性带192条，多态性程度达到80.67％；采用NTSYSpc2.1软件处理数据，结果表明，何首乌样品(株系)的遗传距离变异范围在0.0949～0.4697之间；根据相似性系数，用非加权配对算术平均数法(UPGMA)进行聚类分析的结果表明，供试品种(株系)可分成4个类群，所得分类结果与理论上所期望的情形基本相符合。AFLP能够有效地鉴别何首乌样品，并可通过相似性聚类直观表现样品间的相似程度。
5.通过对何首乌18SrRNA基因的序列研究，发现其基因序列长度都相当保守为1809bp，没有发生颠换、缺失和插入的现象，只发生了碱基替换，而且该基因的种内差异很小，只有部分野生品种间仅有3个相同的变异位点，反映了种内的遗传的稳定性，说明目前研究的样品中何首乌存在两种基因型。
6.18SrRNA基因的保守性则为进行何首乌的真伪鉴定打下了良好的分子基础。通过测序、同源性比较和选择性内切酶图谱，能准确地区分何首乌及其伪品芭蕉，而且DNA测序稳定性强，重现性好结果准确可靠，可作为中药何首乌鉴定的依据。我们的研究结果表明18SrRNA基因是鉴定何首乌和伪品的理想的分子标记。
7.通过对何首乌matK基因的序列研究，发现其基因序列长度都相当保守为1271bp，没有发生颠换、缺失和插入的现象，只发生了碱基替换，通过序列比对，其中在6个样品中发现了12个位点的核苷酸替换；而且DX，JX，XH，DBl，DB2，HN，JD，GX，SX，BK具有相同的序列，没有发现碱基的缺失和插入，该基因存在种内差异。
8.通过LJPGMA法构建的基于matK基因序列系统分支树分为四支，结果表明来自广东和广西的样品全部属于Ⅰ分支，而且分为两个亚支A和B。云南的属于Ⅱ分支，相应的来自湖北宜昌和恩施的样品被分为了Ⅲ和Ⅳ分支。分支Ⅰ，Ⅲ以及亚支A和B都得到了较高的自展支持，分别为57％，95％，88％和67％。其聚类结果与AFLP聚类分析结果相近，这说明何首乌由于分布区域相距较远，气候、土壤等生态环境条件差异较大，已产生了遗传分化。