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低温作为园艺作物中重要的非生物胁迫因子,直接影响猕猴桃的生长发育,轻者造成减产,重者导致死树毁园,培育抗寒性强的猕猴桃品种已经成为育种的重要方向。然而,目前关于猕猴桃抗寒性的研究并不深入,且分子机理的解析相对较少。本研究构建了四个软枣猕猴桃抗寒遗传群体,通过分析亲本核基因组和叶绿体基因组信息挖掘了抗寒相关的功能变异基因;同时以杂交F1代群体的抗寒性遗传规律为基础,通过BSR-Seq筛选抗寒关键基因;选取一个抗寒候选基因进行转拟南芥功能验证,为后续猕猴桃高抗寒性新品种选育提供科学依据。本论文主要包括以下5个方面内容:1. 软枣猕猴桃F1代遗传群体抗寒规律研究。构建四个用于分析抗寒性的杂交群体。杂交子代秋季叶片颜色分析表明,叶片颜色变黄早晚（即落叶早晚）偏父本性状。选取‘Ruby-3’ב魁绿雄’杂交组合（492株）的F1代进行抗寒性鉴定,结果表明F1代群体在-30℃处理后的相对电导率（REL）呈正态分布,抗寒性状出现超亲本现象,极端不抗寒的子代LT50为-7.5℃,极端抗寒的子代LT50为-36.9℃。抗寒遗传群体为后续抗寒机制研究提供材料基础。2. 越冬期软枣猕猴桃、中华猕猴桃和美味猕猴桃抗寒相关生理指标变化规律研究。结果显示,随着冬季气温降低,可溶性糖（SS）含量不断升高,可溶性蛋白（SP）、脯氨酸（Pro）、超氧化物歧化酶（SOD）含量均呈现先上升后下降趋势。生理指标隶属函数值综合分析表明:不同品种猕猴桃抗寒性排序为‘魁绿雄’>‘永丰一号’>‘博山碧玉>’>‘红贝’>‘红阳’>‘徐香’,与LT50评价抗寒性结果基本一致。冬季随着气温降低,四个生理指标含量在抗寒的‘魁绿雄’中累积的最高;生理指标和温度的相关性分析表明除‘博山碧玉’以外的5个品种中SS含量均与平均最高温度呈显著负相关,可溶性糖含量可能是最先响应低温环境的生理指标。生理指标在一定程度反应猕猴桃植株的抗寒性,该研究为后续抗寒功能基因挖掘和功能验证提供生理支持。3. 软枣猕猴桃核基因组和叶绿体基因组变异基因挖掘及验证。对软枣猕猴桃杂交亲本（‘Ruby-3’和‘魁绿雄’）以及两个雄株（‘永丰雄’和‘红贝雄’）进行核基因组重测序分析,在‘Ruby-3’、‘魁绿雄’、‘永丰雄’、‘红贝雄’中共发掘出4,710,650、4,646,026、4,787,750和4,590,616个SNPs位点以及1,481,002、1,471,304、1,534,198和1,425,393个In Dels位点,对非同义突变的基因进行GO和KEGG分析,发现变异基因多富集到缺水响应、淀粉蔗糖代谢、活性氧代谢以及激素信号传导等通路。随机选取120个In Del位点进行验证,结果显示81对引物能扩增出目的条带,其中,64对具有多态性标记。筛选包括CBF转录因子在内的16个变异基因进行越冬期响应低温的q RT-PCR验证,除了未检测到表达变化的4个基因外其余基因均能响应低温信号。杂交母本‘Ruby-3’叶绿体（cp）基因组组装及变异位点分析。‘Ruby-3’cp基因组长度为157,611 bp,包含一对24,232 bp的反向互补重复区（IRs）、20,463 bp的小单拷贝区（SSC）序列和88,684 bp的大单拷贝区（LSC）序列,注释到113个基因,包括79个编码基因,4个r RNA基因,30个t RNA基因。通过软枣猕猴桃和其他三个已测序的猕猴桃种的叶绿体基因组比较分析,在软枣猕猴桃cp基因组中共发现47个SSR多态性位点和155个重复结构,低温下差异表达的叶绿体rbc L和rpo A基因可作为后续的抗寒候选基因分析。cp基因组分析为猕猴桃叶绿体内相关基因的抗寒性研究提供组学信息。4. 抗寒功能基因的挖掘。通过BSR-seq对杂交F1代群体进行测序,共获得响应低温基因28,496个,两个极端池中的差异表达基因共126个,其中上调表达基因59个,下调表达基因67个。GO富集分析显示基因共富集到21个GO通路;KEGG富集分析表明上调差异基因主要富集在淀粉蔗糖代谢、氨基酸和核苷酸代谢通路以及植物信号传导通路。主要差异基因包括10个关键酶编码基因和2个调控基因。编码基因为:腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP glucose pyrophosphorylase,AGP）、淀粉合成酶（Granule-bound starch synthase）、蔗糖合酶（Sucrose synthase,SUS）、葡聚糖分支酶（1,4-alpha-glucan-branch enzyme,GBE）、α-葡聚糖磷酸化酶（alpha-1,4 glucan phosphorylase）、β-淀粉酶（beta-amylase,BAM）、葡聚糖水合激酶（glucan water dikinase,GWD）、中性α-糖苷酶（neutral alpha-glucosidase）和歧化酶（disproportionating enzyme 2,DPE2）编码基因,脯氨酸富集蛋白基因（Proline rich protein,PRP）;调控基因为EIN-binding F box（EBF）和14-3-3,并且这两个基因均能够调控CBF基因的表达。筛选27个差异表达基因进行q RT-PCR验证,实时荧光定量结果和测序结果一致。5. 抗寒候选CBF基因的功能验证。在中华和软枣猕猴桃中克隆CBF基因,研究CBF基因的表达模式表明CBF基因能够响应低温,冬季越冬期CBF在不同品种中表达呈现先升高后降低趋势;超表达软枣猕猴桃AaCBF1后,超表达拟南芥表现出变矮小表型,且超表达植株的相对电导率较野生型降低,抗寒性明显提高;超表达Aa CBF1的拟南芥植株在-2℃低温处理后H2O2和O2-含量更低;超表达植株内可溶性糖和脯氨酸含量、超氧化物歧化酶以及β-淀粉酶含量均高于野生型,推测Aa CBF1基因通过启动下游冷诱导基因的表达提高抗寒性。