CP7菌抗菌蛋白的特性及Cpacin制备方法的探讨

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CP7菌是导师课题组筛选分离的一株高效分泌抗菌物质的多粘类芽孢杆菌。经过连续几年的研究,已经明确该菌分泌的抗菌物质分别为抗G+、G-和真菌的3种性质不同的多肽,三者没有交叉拮抗作用,对多种细菌和真菌均有强烈的抑杀作用,且抗菌物质的活性稳定,显示了其开发利用的良好前景。课题组研究发现,其中的抗G+活性组分为一种由23个氨基酸组成、分子量为2510 Da的新的阳离子型多肽,Cpacin。到目前为止,该菌所产生的不同的活性多肽的一些性质还未十分明了,不同活性组分的分离提纯方法还有待改进。本研究是在现有的基础上,对CP7菌不同活性组分的一些性质作进一步的研究,并对Cpacin的分离纯化和制备方法作进一步的探讨,以期为该菌抗菌蛋白的深层次研究和开发利用提供依据。 1.CP7菌发酵上清液经105℃、110℃、115℃、120℃各温度处理20min,对其抗G+和G-的组分活性有一定的影响,并且有随着温度的升高活性逐渐降低的倾向,但到120℃仍能保持51%-78%的生物活性,说明这些活性组分对超过100℃的高温有一定的耐受性。而抗真菌组分则不具备这种特性。 2.把CP7菌发酵上清液在常温、4℃、-20℃、-40℃、-70℃下保存,发现抗G-和G+的抑菌活性经20天保存后,其活性有随时间的延长而降低的倾向,但变化都不明显。而抗真菌活性组分在4℃和常温下保存,一周内活性降低不明显,但超过一周后,其活性降低越来越明显,并且4℃保存比常温影响更大;而在-20℃、-40℃、-70℃下保存一天后抑菌活性就明显下降。表明CP7菌发酵液中抗G-菌和G+菌的活性组分可以耐低温保存,而抗真菌的活性组分可以在常温下作短期保存,但不宜在冰点下保存。 3.本研究摸索出真空浓缩CP7菌发酵液中不同活性组分时的适宜温度:抗G+的活性组分真空浓缩的适宜温度为60℃~70℃,抗G-的活性组分真空浓缩的适宜温度为60℃~65℃,而抗真菌的活性组分只能在28℃~45℃之间。 4.本研究在徐凤霞(2007)的基础上,建立了适合于大量制备Cpacin的新的工艺路线,即用阳离子交换层析代替Sephardex G-100凝胶过滤层析,其分离产物经北京军事科学院国家生物分析中心检测,从其分子量和氨基酸序列推断,属于Cpacin的同系物,证明了此方法的可行性。该技术路线的建立为制备Cpacin以及对Cpacin开发利用打下了基础。 5.进一步探讨了Cpacin精制条件,用2次阳离子交换层析代替Sep-Park Cartridges柱层析(固相萃取)和Sephardex G-100,在反相高效液相色谱时改洗脱液0%~100%ACN(含0.05%TFA,V/V)梯度洗脱为28%乙腈(含0.05%TFA,V/V)单浓度洗脱,效果良好,为深入研究Cpacin的高级结构及其开发利用奠定了基础。
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