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绦虫感染给家禽养殖业带来巨大经济损失。多房棘球绦虫EM10皮层蛋白被认为是寄生虫感染诊断和抗泡型和囊型包虫病疫苗制备的理想候选抗原分子。本实验在四角瑞利绦虫中用RT-PCR和RACE方法扩增了EMIO的同源蛋白基因并命名为RT10。并用一些分子生物信息学软件和网站对RT10抗原基因cDNA进行了分析,以及将其编码区进行了表达,结果如下所列:
1、采用RT-PCR和RACE方法扩增了1877bp的RT10基因cDNA序列,其中包括1683bp的ORF,194bp的3UTR,而5UTR没有扩增。在序列末端有典型的多聚腺苷酸加尾信号序列(AATAAA),而在其它绦虫种中并不存在加尾信号。编码区GC含量为49.44%,基因编码560个氨基酸的蛋白,比其它绦虫种的同源蛋白多1个氨基酸,等电点(pI)为6.53,分子量为65.4KD,亲水性氨基酸占总氨基酸的65.71%。在线疏水性和跨膜肽段分析显示RT10抗原具有很高的亲水性特征,并且没有跨膜肽段结构,表明RT10蛋白为一个膜外在蛋白。没有信号肽序列,所以RT10蛋白为非分泌蛋白,RT10蛋白的三级结构像一锤头形状。
2、三个单FERM结构域(FERM-N,FERM-M和FERM-C)和两个多结构域(B41和ERM)存在于RT10皮层蛋白中。这些保守性结构域存在于人红血球带4.1蛋白,埃兹蛋白(ezrin),根蛋白(radixin),膜突蛋白(moesin)和梅林(merlin)等蛋白中,它们以PIP2的方式介导细胞膜和细胞骨架的连接,并在维持细胞整合,一些人类疾病以及信号转导中发挥重要作用。
3、四角瑞利绦虫RT10抗原基因的核酸和蛋白序列以及其它种的同源体序列经多重比对后构建了系统发育树。在以核酸或者蛋白序列构建的发育树中,四角瑞利绦虫均被为单独一支,带科绦虫分到一支,棘球属分到另一支,这满足分子分类和经典形态种属分类的一致性。
4、四角瑞利绦虫RT10基因编码序列克隆到表达载体pET-21d后在E.coliBL21(DE3)表达宿主菌中表达,SDS-PAGE电泳后经考马斯亮蓝显色后与蛋白marker比较确定RT10蛋白为目的蛋白。
下一步实验可以用RT10皮层抗原核酸序列或蛋白通过PCR扩增或者血清学的方法来对寄生虫感染进行诊断,为开发新型方便的抗禽类绦虫感染疫苗打下基础,将有益于家禽养殖业的健康发展。