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第一部分PKD对Rictor的转录后调控机制的研究目的和意义Rictor (Rapamycin-insensitive companion of mTOR)是mTOR复合物2(mTORC2)中一个新确定的蛋白成员,参与调节mTORC2信号及其下游靶基因如Akt和SGK1。mTORC2作为mTOR信号通路中一个新的复合物,对其调控的分子及自身调控的报道研究仍不完善,且对Rictor上游的相关调控尚无文献报道。本研究拟检测蛋白激酶D (PKD)与Rictor的相互作用,从而探索PKD对Rictor的调控机制,并深入了解Rictor作为mTORC2中的成员在肿瘤发生发展中的作用,以期指导恶性肿瘤的生物靶向治疗。材料和方法1、主要材料293T、HT29和HCT116细胞,G66976、G56983和CID755673, MG132,CHX,抗体(PKD1、PKD2、PKD3、Rictor、mTOR、Raptor、p-Akt和Akt),组织芯片,RNA提取试剂盒,逆转录试剂盒,免疫组织化学相关试剂,免疫印迹及免疫共沉淀相关试剂。2、方法2.1细胞培养293T细胞使用含10%FBS的DMEM培养,HT29和HCT116细胞采用含10%FBS的McCoy’s5A培养,所有细胞置于37℃,5%C02,湿度充分的恒温培养箱中。2.2慢病毒的包备与稳定株的建立将7×106个293T细胞分别种于100mm培养皿中培养过夜,按照说明书使用Lipfectmin2000转染相应的质粒入细胞中(shRNA、pPAX2和pMD2G各个质粒的转染比例为4：3：1),转染后6小时换新鲜培养液,48小时后收集细胞上清,离心过滤后即为病毒悬液。测试病毒滴度后取等量的病毒液置于待感染的细胞,并补等量的培养液培养48小时。根据细胞对puromycin的敏感度采用不同浓度的puromycin筛选1-2周后,Real-time PCR鉴定筛选稳定表达株。剩余病毒液分装后置于-70℃保存备用。2.3细胞总RNA提取与Real-time PCR1×106细胞种于6孔板中常规培养过夜。采用RNeasy Mini试剂盒提取总细胞RNA,紫外分光光度计定量后,取1μg总RNA用无RNA酶的纯净水补至10μl,加入预先配制好的10μl/反应的逆转录酶混合液中,上机25℃10min、37℃120min和85℃10sec,将总RNA逆转录生成cDNA。按Taqman基因表达检测方法检测PKD2, PKD3和Rictor的mRNA水平。2.4蛋白样品制备及免疫印迹转染后48小时或相应处理后按指定时间收集细胞。采用1%Triton裂解液常规冰上裂解细胞蛋白30min (20mM Tris-HCl (pH7.5),150mM NaCl,1mM Na2EDTA,1mM EGTA,1%Triton,2.5mM sodium pyrophosphate,1mM beta-glycerophosphate,1mM Na3VO4,1g/ml leupeptin),低温高速离心后检测蛋白浓度。加入上样缓冲液的蛋白裂解液加热至95℃、5min变性后,取等量的蛋白用MOPS SDS电泳缓冲液于4-12%Bis-Tris梯度胶电泳200V、60min分离蛋白,NuPAGE转移缓冲液中70V、120min将蛋白转移至预先用甲醇处理的PVDF膜。5%脱脂牛奶室温封闭1小时后分别采用特异性的一抗4℃孵育过夜。TBST洗膜,5分钟×3次；加入对应的二抗(α-Rabbit抗体1:5000; α-Mouse抗体1：4000)室温孵育1小时,TBST洗膜,于暗室中ECL或ECL plus显影曝光。2.5免疫共沉淀细胞分别转染相应的质粒48小时后,常规裂解细胞。定量后每组取500μg蛋白进行实验。首先每组蛋白使用20μl protein G PLUS凝胶珠4℃预孵育半小时,离心后弃去沉淀。取上清分别加入Myc抗体锚定的凝胶珠20μl或正常IgG作阴性对照,置于4℃360°旋转器上过夜孵育。次日,使用裂解液将凝胶珠充分洗净后加入等量的2×上样缓冲液混匀,加热至95℃、5min变性,所得样品全部上样,行Western Blot检测相应蛋白的表达水平。2.6细胞增殖及克隆形成实验将1×105个构建的空白对照、Rictor、PKD2、PKD3和PKD2&3稳定敲低表达细胞株种于6孔板中常规培养,每3天更换培养基,并于第1天和第7天分别用胰酶消化细胞成单细胞悬液,细胞仪(Beckman coulter)计数细胞数量,直接比较细胞增殖速度。另外,配制含0.8%软琼脂的培养基事先铺于60mm培养皿中,超净台中充分凝固。将等数量上述稳定表达株的单细胞重悬于含0.4%软琼脂的培养基中,铺于处理后的培养皿上,置于超净台中常温凝固。转移入37℃、5%CO2、湿度充分的恒温培养箱中培养10～12天后取出,甲醛固定,0.005%结晶紫染色后显微镜下计数细胞克隆形成数目。2.7免疫组织化学组织芯片置于58℃烤箱中孵育固定30min后,立即依次转移入二甲苯中5minx2次、95%乙醇3minx2次、双蒸水×2次,脱蜡至水。3%H202室温封闭组织切片10min,PBS缓冲液冲洗2次后,放入盛有抗原修复液0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH=7.0)的耐高温容器,在微波炉里加热至沸腾后,断电,间隔5～10min,反复2次后停止冷却至室温；滴加正常血清封闭液,室温20mmin,甩去多余液体；分别滴加稀释后的Rictor、PKD2和PKD3抗体,每组均以抗体稀释液作为空白对照,4℃孵育过夜；PBS缓冲液5min×3次,滴加相应的生物素化二抗,室温孵育20min; PBS缓冲液5min×3次,DAB显色(镜下掌握显色程度及时间)；双蒸水洗,苏木素复染20sec,盐酸酒精分化1sec；乙醇脱水、二甲苯透明,中性树脂封片后镜检拍照。2.8数据统计Real-time PCR、细胞增殖、克隆形成实验结果用三次实验结果的x±SD表示,均采用两独立样本t检验分析,检验水准以P<0.05认为差异有统计学意义,以上分析使用SPSS13.0完成。结果1、PKD2和PKD3共同参与Rictor的调节Go6976处理结肠癌细胞后Rictor的表达降低,而Go6983对Rictor的表达无明显影响；特异性PKD抑制剂CID755673也可抑制Rictor的表达,这就说明PKD可能参与Rictor的表达调控(图1-2.A)。但是采用shRNA分别抑制PKD三个亚型PKD1、PKD2和PKD3的表达,未能对Rictor的表达产生影响(图1-2.B)；同样的,在HT29中分别过表达PKD1和PKD2,对Rictor蛋白水平均无影响(图1-2.C)。当我们使用PKD3的腺病毒感染结肠癌细胞后发现,Rictor蛋白水平增加,且其下游靶基因Akt的磷酸化水平也同时增加(图1-2.D)。综合以上结果,PKD抑制剂可抑制Rictor的表达,而单独抑制其中任意—个亚基均不能起到相同的作用,因此,PKD对Rictor的调控可能是通过两个或以上的PKD亚型同时起作用。将PKD2shRNA和PKD3shRNA同时感染HT29细胞建立稳定双重敲低表达株,免疫印迹验证成功敲低PKD2和PKD3的表达。此时检测Rictor的表达水平较空白对照组降低,同时Akt磷酸化水平也降低(图1-2.E)。因而我们推测,PKD对Rictor的调控主要是通过PKD2和PKD3两个亚型来实现的。2、PKD2和PKD3能与Rictor相结合Real-time PCR检测了PKD对Rictor mRNA水平的影响,GAPDH为内参,每组实验重复3次,结果取平均值,以两独立样本t检验分析数据。如图1-3.A所示,PKD2和PKD3双重敲低稳定表达细胞(PKD2&3sh)与空白对照细胞(Ctrlsh)中PKD2mRNA的表达分别为0.16±0.016和1.00±0.046,PKD3的表达分别为0.12±0.020和1.00±0.058,PKD2和PKD3mRNA水平差异具有统计学意义(t值分别为24.910和30.200,P值为0.000和0.000),提示稳定敲底表达株构建成功；两细胞中Rictor的表达分别为0.86±0.346和1.00±0.097,差异无统计学意义(t值为0.705,P值为0.520)；如图1-3.B所示,腺病毒过表达PKD3细胞(Ad-PKD3)与空白对照细胞(Ad-Ctrl) PKD3的表达为17.05±0.181和1.00±0.026,PKD3表达水平差异具有统计学意义(t值为-151.500,P值为0.000),Rictor的表达水平为4.81±0.297和4.27±0.524,差异无统计学意义(t值为-1.544,P值为0.198)。因此,PKD并不是从转录水平影响Rictor的表达。接下来,我们想进一步验证PKD与Rictor蛋白间的相互作用。HCT116细胞共同转染Myc-Rictor和GST-PKD1或Myc-Rictor和GST-PKD2,免疫共沉淀实验发现PKD2可与Rictor相结合,IgG对照组无结合,但未检测到PKD1与Rictor的相互作用(图1-3.C)；另外,PKD3腺病毒高表达的细胞转染Myc-Rictor,用Myc (Myc-Rictor)标记的凝胶珠与蛋白孵育后,免疫印迹检测到了PKD3的表达,说明PKD3也可与Rictor蛋白相结合(图1-3.D)。这就进一步证实了我们的假设,PKD1不与Rictor蛋白结合,未直接参与Rictor的调节,而PKD2和PKD3则可通过与Rictor直接或间接的结合来调控其蛋白水平的表达。3、Rictor通过泛素化途径降解,过表达PKD3可抑制Rictor的降解基于以上结果得知,PKD对Rictor是转录后水平的调控,这就包括翻译水平和蛋白稳定性的调控。26蛋白酶体信号通路参与蛋白转录后调节,蛋白被泛素化修饰后即被蛋白酶体进一步的水解成多肽。MG132为一个常用的真核细胞蛋白酶体抑制剂,可透过细胞膜选择性的抑制蛋白酶体。如图1-4.A所示,使用MG132处理HT29细胞不同的时间,发现Rictor的表达水平增加,mTOR信号通路中的mTOR和Raptor分子水平也有所增加,同时伴有mTORC2下游靶分子Akt的磷酸化水平增加。随后,我们采用CHX(放线菌酮,蛋白合成抑制剂)抑制细胞新的蛋白的合成,发现Rictor蛋白的表达水平随着处理时间的延长而降低(图1-4.B)。因此,可以确定Rictor蛋白是通过26蛋白酶体通路来降解的。为进一步明确PKD对Rictor蛋白的调控是否是通过26蛋白酶体途径来实现,我们设计了CHX追逐实验进行验证。CHX (cycloheximide)为一种蛋白合成抑制剂,可以抑制真核细胞蛋白的合成,常用于观察蛋白的稳定性。如图1-4.C所示,在对照细胞中,Rictor蛋白随CHX处理时间的延长而降低,说明Rictor蛋白处于正常的降解过程中；而在PKD3过表达的细胞中,CHX处理细胞几乎不引起Rictor蛋白的降解,说明过表达PKD3可增加Rictor蛋白的稳定性,抑制了Rictor蛋白的降解。4、PKD和Rictor不影响结肠癌细胞的增殖如图1-2.D和1-2.E所示,PKD可通过影响Rictor的表达进而改变Akt的磷酸化水平。众所周知,Akt在肿瘤细胞增殖、分化、凋亡和转移过程中起着重要的作用,且有报道指出,抑制mTOR可抑制肿瘤细胞的增殖。计数等量的各个稳定细胞株培养7天,分别于第1天和第7天计数细胞,以第7天与第1天细胞的增殖倍数作为结果比较。如图1-5.A,在HCT116和HT29中,Rictor敲低表达(Rictor sh)与空白对照(Ctrlsh)细胞的增殖速度分别为17.25±3.256、21.17±2.926和14.72±2.104、11.70±2.405,此次实验采用两样本t检验分析,组间差异无显著性(t值分别为1.552和1.633,P值分别为0.196和0.178)。然后我们观察PKD各个亚型对肿瘤细胞增殖的影响(图1-5.B和图1-5.C),HCT116和HT29对照细胞与PKD2或PKD3敲低表达细胞(PKD2sh或PKD3sh)的增值速度分别为27.79±3.150、30.61±2.706或29.08±0.995和50.16±12.928、43.88±4.638或35.22±3.846,采用两样本t检验差异无统计学意义(t值分别为-1.176、-0.647和0.792、1.919,P值分别为0.305、0.537和0.472、0.127)。HCT116和HT29对照细胞与双重敲低表达细胞(PKD2&3sh)的增值速度分别为27.17±7.029、30.31±5.108和10.45±1.433、13.24±3.476,采用两样本t检验差异无统计学意义(t值分别为-0.626和-1.285,P值分别为0.565和0.268)。5、抑制PKD和Rictor降低结肠癌细胞的致瘤性于是,我们采用软琼脂集落形成实验观察PKD和Rictor对肿瘤细胞致瘤性的影响(图1-6)。结果发现,空白对照细胞(Ctrlsh)与Rictor敲低表达细胞(Rictorsh)、空白对照细胞与PKD2&3双重敲低表达细胞(PKD2&3sh)的克隆形成数目分别为180.00±22.869、63.33±12.097和119.33±27.791、42.67±35.233,抑制Rictor和PKD2&3均能显著抑制结肠癌细胞的致瘤作用,差异具有统计学意义(t值为7.811和2.959,P值分别为0.001和0.042)。6、PKD和Rictor在结肠癌原位及转移肿瘤中高表达最后,我们检测了结肠正常组织、原位和肿瘤肝转移组织中PKD和Rictor的表达水平。图1-7分别显示了各个蛋白在组织中的表达,可见在结肠正常组织中,Rictor、PKD2和PKD3的表达水平较低或不表达,而在原位及肿瘤肝转移组织中,三者的表达水平均较高。原位肿瘤组织中Rictor和PKD2主要表达在细胞浆中,PKD3在细胞浆和细胞核中均有表达；而在肿瘤肝转移组织中三者在细胞核和细胞浆均有表达,随着肿瘤的进展程度,PKD和Rictor在细胞内聚集的位置发生了一定的改变,进一步提示Rictor、PKD2和PKD3均与结肠癌的进展有关。结论获得了蛋白激酶D (PKD)参与调节Rictor/mTOR信号通路的证据。过表达PKD3可增加Rictor的蛋白水平,而同时抑制PKD2和PKD3可降低Rictor蛋白的水平,两种调节均不影响Rictor的mRNA水平；PKD2和PKD3在结肠癌细胞中能与Rictor结合并增强其下游靶基因Akt的活性；PKD3可影响Rictor蛋白的稳定性；PKD和Rictor对结肠癌细胞的增殖无明显的影响,但可增加其致瘤性；PKD和Rictor在结肠原位和肝转移肿瘤组织中均高表达。以上结果均提示PKD在一定程度上参与了Rictor的转录后调控,从蛋白的修饰方面影响了Rictor蛋白的稳定性,从而参与Rictor/mTOR信号通路的调控；抑制PKD可下调Rictor蛋白的表达,并抑制结肠癌细胞的致瘤性,为肿瘤的生物靶向性治疗提供的一定的理论依据。第二部分Rictor在mTOR非依赖的信号通路中的调控研究目的和意义Rictor (Rapamycin-insensitive companion of mTOR)作为mTORC2中的成员,可磷酸化并激活Akt,激活的Akt可诱导c-Myc和cyclin E的表达,从而对结肠癌细胞增殖和周期起重要的调节作用。本研究检测了Rictor在mTOR信号通路非依赖的调控的作用,与FBXW7相互作用作为一个E3复合物调节c-Myc和cyclin E蛋白的降解,并了解该调节在肿瘤发展及治疗中的作用。本课题发现了Rictor在结肠癌肿瘤中新的调控作用,对新的临床用药指导有着重要的意义。材料和方法1、主要材料293T、SW620、HT29和HCT116细胞,MG132, CHX,抗体(ubiquitin、 c-Myc、cyclin E、Rictor、mTOR、Raptor p-Akt和Akt), RNA提取试剂盒,逆转录试剂盒,免疫印迹相关试剂,免疫共沉淀相关试剂。2、方法2.1细胞培养293T和SW620细胞使用含10%FBS的DMEM培养,HT29和HCT116采用含10%FBS的McCoy’s5A培养,HCT116-FBXW7+/+和HCT116-FBXW7-/-同样培养于含10%FBS的McCoy’s5A培养液中。所有细胞采用上述培养基置于37℃,5%CO2,湿度充分的恒温培养箱中。2.2慢病毒的包备与稳定株的建立将7×106个293T细胞分别种于100mm培养皿中培养过夜,按照说明书使用Lipfectmin2000转染相应的质粒入细胞中(shRNA、pPAX2和pMD2G各个质粒的转染比例为4：3：1),转染后6小时换新鲜培养液,48小时后收集细胞上清,离心过滤后即为病毒悬液。测试病毒滴度后取等量的病毒液置于待感染的细胞,并补等量的培养液培养48小时。根据细胞对puromycin的敏感度采用不同浓度的puromycin筛选1-2周后,Real-time PCR鉴定筛选稳定表达株。剩余病毒液分装后置于-70℃保存备用。2.3细胞总RNA提取与RT-PCR1×106细胞种于6孔板中常规培养过夜。采用RNeasy Mini试剂盒提取总细胞RNA,紫外分光光度计定量后,取1μg总RNA用无RNA酶的纯净水补至10μl,加入预先配制好的10μl/反应的逆转录酶混合液中,上机25℃10min、37℃120min和85℃10sec,将总RNA逆转录生成cDNA。根据靶基因序列及参考文献设计引物,Hotstart热启动酶扩增目的DNA片段,凝胶电泳分离后紫外灯观察拍照。2.4蛋白样品制备及免疫印迹转染后48小时或相应处理后按指定时间收集细胞。采用1%Triton裂解液常规冰上裂解细胞蛋白30min (20mM Tris-HCl (pH7.5),150mM NaCl,1mM Na2EDTA,1mM EGTA,1%Triton,2.5mM sodium pyrophosphate,1mM beta-glyceropho sphate,1mM Na3VO4,1g/ml leupeptin),低温高速离心后检测蛋白浓度。加入上样缓冲液的蛋白裂解液加热至95℃、5mmin变性后,取等量的蛋白用MOPS SDS电泳缓冲液于4～12%Bis-Tris梯度胶电泳200V、60min分离蛋白,NuPAGE转移缓冲液中70V、120min将蛋白转移至预先用甲醇处理的PVDF膜。5%脱脂牛奶室温封闭1小时后分别采用特异性的一抗4℃孵育过夜。TBST洗膜,5分钟×3次；加入对应的二抗(a-Rabbit抗体1:5000; a-Mouse抗体1：4000)室温孵育1小时,TBST洗膜,于暗室中ECL或ECL plus显影曝光。2.5免疫共沉淀细胞分别转染相应的质粒48小时后,分别采用1%Triton裂解液或0.3%CHAPS裂解液裂解细胞。定量后每组取500μg蛋白进行实验。首先每组蛋白使用20μl protein G PLUS凝胶珠4℃预孵育半小时,离心后弃去沉淀。取上清分别加入抗体1μg或抗体锚定的凝胶珠20μl,置于4℃360°旋转器上过夜孵育。次日,加入抗体的实验组再给予20μl protein G PLUS凝胶珠4℃旋转孵育4小时。使用相应裂解液将凝胶珠充分洗净后加入等量的上样缓冲液加热至95℃、5min变性,所得样品全部上样行Western Blot检测相应蛋白的表达水平。2.6体内泛素化水平检测蛋白泛素化水平检测时,将His-ubiquitin表达载体与指定的质粒共转染入细胞内,收集细胞4小时前使用MG132处理细胞。100μl0.3%CHAPS裂解液常规裂解细胞,加入10%SDS10μl混匀后加热至95℃、5min变性蛋白,再加入900μl0.3%CHAPS裂解液超声裂解20秒,离心后用免疫共沉淀方法检测细胞内靶蛋白的泛素化水平。2.7数据统计本部分未涉及统计学处理。结果1、Rictor调节c-Myc和cyclin E蛋白的表达水平过去的研究充分表明,Akt的激活可增加c-Myc和cyclin E的表达。因而我们想进一步了解,mTORC2活性的抑制对c-Myc和cyclin E表达的影响。在稳定转染Rictor shRNA了的SW620和HT29细胞中,敲低Rictor并未明显影响到c-Myc和cyclin E的表达；然而,同样的细胞给予血清饥饿刺激后再检测c-Myc和cyclin E,发现抑制Rictor可明显增加两者的表达水平(图2-3.A),这就与之前的报道存在一定的差别。另外,我们使用MG132(一个特异性的细胞26蛋白酶体抑制剂,可抑制蛋白的降解)来处理血清饥饿后的细胞,结果发现,MG132能够逆转Rictor敲低所引起的c-Myc和cyclin E蛋白水平的增加(图2-3.B)。这就说明,26S蛋白酶体信号通路参与了Rictor的这一调节。为了进一步验证我们的结果,使用Rictor的siRNA转染入细胞中瞬时压低Rictor的表达,收集蛋白前使用血清饥饿预处理细胞,发现siRNA瞬时抑制Rictor的表达后也可使c-Myc和cyclin E的表达增加(图2-3.C)。如图2-3.D所示,过表达Rictor同样可以抑制c-Myc和cyclin E蛋白水平的表达。有趣的是,在SW620Rictor shRNA稳定敲低表达细胞中,RT-PCR结果显示,Rictor低表达可抑制c-Myc和cyclin E的mRNA水平,与其对蛋白水平的调控相反(图2-3.E)。综上所述,Rictor在无血清的培养状态下可调节c-Myc和cyclin E蛋白水平的表达。由于Akt磷酸化激活后导致c-Myc和cyclin E表达水平的增加,而此前有报道指出Rictor敲低表达可导致Akt的去磷酸化和失活表达,Akt表达水平的变化导致c-Myc和cyclin E mRNA及蛋白水平降低。故我们有理由相信,Rictor是通过mTORC2/Akt非依赖的信号通路来调节c-Myc和cyclin E蛋白的表达。2、Rictor与FBXW7的相互作用作为一个E3的组成部分,FBXW7可影响其靶基因c-Myc和cyclin E的泛素化修饰从而促进它们的降解。故我们推测Rictor是否通过与FBXW7相结合来进一步调控c-Myc和cyclin E。Myc-Rictor分别与Flag-FBXW7α、Flag-FBXW7p和Flag-FBXW7y共同转染入细胞中,免疫共沉淀结果显示,Rictor与FBXW7的三个亚型均有结合(图2-4.A)。由于mTOR也是FBXW7下游的靶基因之一,可与FBXW7结合后被泛素化修饰、降解,故我们需要进一步的实验鉴别Rictor与FBXW7的结合与mTOR/FBXW7的关系。我们构建了3个包含Rictor蛋白不同片段的表达载体(所有截短载体均包含碳末端),测序鉴定成功后分别与Flag-FBXW7a共同转染入细胞中。如图2-4.B所示,在3个Rictor截短表达载体及全长Rictor载体中,同时检测到FBXW7a和mTOR的结合表达。我们需要进一步的实验来鉴别Rictor/FBXW7复合物是否是通过mTOR而间接连接的。1%Triton裂解液可破坏mTORC2,而0.3%CHAPS裂解液则较缓和,能保持mTORC2的完整性。如图2-4.C所示,在使用1%Triton和0.3%CHAPS裂解液的两组实验中均检测到了Rictor与FBXW7a的相互作用,而Rictor与mTOR的相互作用仅能在使用0.3%CHAPS裂解液的实验组中检测到。这就说明,Rictor和FBXW7的相互作用是独立于mTORC2以外的。由于我们所检测到的Rictor对c-Myc和cyclin E蛋白水平的调控是在无血清培养的条件下的,那么Rictor与FBXW7的作用是否也依赖于血清饥饿而存在呢?如图2-4.D所示,在血清培养和血清饥饿培养的转染细胞中,均检测到了Rictor与FBXW7的相互作用,说明Rictor/FBXW7复合物是不依赖于血清饥饿而存在的。3、Rictor通过FBXW7调节c-Myc和cyclin E基于以上实验结果,我们推测Rictor对c-Myc和cyclin E的调节可能是通过与两者特异性的E3-BXW7共同组成E3复合物来起作用的。因此,我们在野生型FBXW7+/+和缺失型FBXW7-/-细胞中分别建立Rictor shRNA稳定敲低表达株及空白对照株。如图2-5.A所示,在野生型(FBXW7+/+)HCT116细胞中敲低Rictor表达后可诱导c-Myc和cyclin E的表达,但在缺失型(FBXW7-/-)HCT116细胞中同样的处理未见c-Myc和cyclin E表达水平的变化。同时,HCT116control shRNA和Rictor shRNA稳定细胞株中分别转染空白质粒和Flag-FBXW7a表达载体,结果显示,FBXW7a在对照细胞中可降低c-Myc和cyclin E的蛋白水平,而在Rictor敲低表达的细胞中该作用明显减弱(图2-5.B)。4、Rictor调节FBXW7的稳定性Rictor与FBXW7结合后对其作为一个E3复合体有什么样的影响呢?首先,我们进行了RT-PCR实验比较Rictor敲低表达的稳定细胞株和阴性对照细胞株中FBXW7表达水平的差异,结果发现,抑制Rictor表达并未明显影响FBXW7mRNA的水平(图2-6.A),Rictor并没有从转录水平影响FBXW7的表达。然后,我们检测了FBXW7在体内的泛素化水平。如图2-6.B所示,在Rictor敲低表达的稳定细胞株中,Flag-FBXW7a蛋白泛素化水平明显较阴性对照细胞中高,证明抑制Rictor的表达可解聚Rictor/FBXW7复合体,进而促进了FBXW7a的降解。CHX能抑制真核细胞蛋白的合成,使用CHX可观察蛋白降解半衰期的时长,因此CHX追逐实验广泛被应用于蛋白稳定性的检测。图2-6.C显示,在Rictor敲低表达的稳定细胞株中,Flag-FBXW7a蛋白的稳定性明显较阴性对照细胞低,从而进一步验证了我们的假设。5、Rictor/FBXW7启动c-Myc和cyclin E的泛素化那么Rictor与FBXW7结合后是如何调节c-Myc和cyclin E的呢?由于FBXW7对c-Myc和cyclin E的调节是通过泛素化修饰来实现的,而且图2-3.E已经显示抑制Rictor表达可在mRNA水平上抑制c-Myc和cyclin E(与蛋白水平的变化不一致),因而我们有理由相信,Rictor在此对c-Myc和cyclin E的调节也是通过与FBXW7相互作用,从蛋白水平上修饰c-Myc和cyclin E来实现的。如图2-7.A和图2-7.C所示,在Rictor敲低表达的稳定细胞株中, c-Myc和cyclinE的泛素化水平明显降低。而且,在野生型HCT116细胞中,敲低Rictor可抑制c-Myc和cyclin E的泛素化；在缺失型(FBXW7-/-) HCT116细胞中,c-Myc和cyclin E的泛素化水平已经很低,抑制Rictor的表达不能进一步抑制两者的泛素化(图2-7.B和图2-7.D)。6、Rictor降低c-Myc和cyclin E的稳定性使用CHX追逐实验观察c-Myc和cyclin E的稳定性与Rictor表达的相关关系。如图2-8.A和图2-8.C所示,抑制Rictor的表达可延长c-Myc和cyclin E蛋白降解的半衰期。本研究中使用的Rictor shRNA序列针对的是Rictor的3’-UTR区,在Myc-Rictor表达载体上无作用位点,故可以使用Myc-Rictor表达载体在Rictor敲低表达稳定细胞中重新表达Rictor蛋白。如图2-8.B和图2-8.D所示,Myc-Rictor表达载体在Rictor敲低表达稳定细胞中表达良好,且Rictor的重新表达可缩短c-Myc和cyclin E蛋白的半衰期,从而促进c-Myc和cyclin E的降解。7、Rictor能与USP28结合,但不参与USP28的去泛素化调节USP28作为一个去泛素化特异蛋白,可与FBXW7相结合来平衡其下游的靶基因如c-Myc的泛素化与去泛素化修饰,从而影响c-Myc蛋白水平。如图2-9.A所示,在HT29中感染USP28shRNA建立稳定表达株,发现抑制USP28的表达可抑制c-Myc蛋白水平；在HCT116细胞中转染Flag-USP28表达载体,过表达USP28可增加c-Myc蛋白水平,抑制或增加USP28的表达均不影响cyclin E的表达,说明USP28能特异的将c-Myc去泛素化进而抑制其降解,这与前人的发现是一致的。那么,Rictor/FBXW7复合物中是否也存在USP28呢?结果发现,Rictor也能与USP28特异性相互结合,且mTOR没有参与该复合物的形成(图2-9. B)。Rictor是否参与USP28/FBXW7复合物对底物去泛素化的调节呢?在Rictor稳定敲低表达细胞和空白对照细胞中,免疫共沉淀检测FBXW7与USP28间的相互作用并没有受Rictor表达水平的影响(图2-9.C),且抑制Rictor的表达不能逆转USP28所致的c-Myc蛋白增加(图2-9.D),提示USP28与FBXW7的相互作用与Rictor无关,Rictor可通过FBXW7与USP28形成复合物,但Rictor的表达水平对USP28的去泛素化作用无明显的影响。8、Rictor可能参与Rapamycin诱导的耐药大量研究工作表明,Rapamycin是通过与mTORC1直接结合来抑制mTORC1信号通路的活性,但也有研究表明长时间Rapamycin的处理也可抑制Rictor的活性。Rapamycin可通过抑制mTOR信号通路来抑制肿瘤的生长,但并不是所有的肿瘤细胞都对Rapamycin的治疗有反应,有些肿瘤细胞就对Rapamycin不敏感,因此明确肿瘤细胞对其耐药的机制就显得尤为重要。如图2-10.A所示,Rapamycin处理HT29和SW620(Rapamycin不敏感细胞)24小时后,Rictor蛋白水平降低,而c-Myc、cyclin E和磷酸化的Akt水平增加。另外,Rapamycin对c-Myc和cyclin E的mRNA无明显影响或仅轻度抑制(图2-10.B),说明Rapamycin诱导的c-Myc和cyclin E增加与激活的Akt无关。以上结果说明Rapamycin可能通过抑制Rictor/FBXW7的活性来激活c-Myc和cyclin E的表达,从而诱导耐药的产生。结论发现了Rictor独立于mTOR信号通路以外的调控作用。Rictor可作为一个调节子与FBXW7相结合,从而参与调控与其相关的靶基因如c-Myc和cyclin E的降解；血清饥饿抑制了mTORC/Akt参与的c-Myc和cyclin E的正向调控,在此基础上,抑制Rictor可抑制两者的泛素化修饰,增加两者蛋白的稳定性,导致c-Myc和cyclin E蛋白水平的增加；在血清培养条件下,Rictor同样可与FBXW7形成复合物,且该复合物是独立于mTOR信号通路以外的；Rapamycin诱导的肿瘤细胞耐药性与Rictor的这一调控作用有关。以上结果均提示Rictor存在与mTOR不相关的调控作用,且其调控的结果可能与mTOR信号通路的调节起到相反的作用,因此,应用Rictor作为生物治疗的靶点时应全面考虑到其各个方面的作用,利用其在抗肿瘤治疗中有利的一面,同时避免或抑制其他副作用的产生。