【摘 要】
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在家畜冷冻精液的研究中,无论采用何种冷冻保护剂、何种冷冻方法都损害了精子的受精能力,并伴随有蛋白质的丢失、表达量的改变、功能活性的增减等。本研究以普通冻精为实验材
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在家畜冷冻精液的研究中,无论采用何种冷冻保护剂、何种冷冻方法都损害了精子的受精能力,并伴随有蛋白质的丢失、表达量的改变、功能活性的增减等。本研究以普通冻精为实验材料,镜检合格后对不同的精子蛋白制备方法、水化液成分和优化2D电泳程序进行了探索,建立了牛精子蛋白质组学研究技术平台,同时以购买的牛新鲜精液和同一批次的冷冻精液为实验材料,通过差异凝胶电泳寻找冻融前后精子蛋白的改变,旨在通过揭示冷冻保存所导致的蛋白质组结构和功能改变的实质,充分阐明冷冻损伤的机理。结果表明:(1)通过比较两种不同的精子蛋白制备方法(尿素-盐酸胍两步裂解法和TRIzol法),最终确定热TRIzol法更适于精子蛋白质组学研究。(2)通过对精子蛋白精确定量,率先采用TRIzol方法结合24cm(pH 3-10)L胶条对牛精子蛋白进行2-DE,并优化了IEF程序和筛选了染色方式,建立了稳定的牛精子蛋白质组学研究技术平台。(3)差异凝胶电泳揭示牛精子蛋白在冻融后有质和量的改变:冻融后缺失的蛋白点有20个,表达下调的有2个,表达上调的有10个。(4)通过对胶内酶解程序的探索,建立了适于银染蛋白点进行质谱分析的胶内酶解程序。(5)成功鉴定阳性对照BSA和胶上恒定表达的蛋白点。作为一项阶段性的实验成果,本研究建立的2D平台和所发现的冻融引起的差异表达蛋白质点结合后续差异蛋白点质谱鉴定结果将为揭示冷冻损伤机理奠定较好的基础。同时该研究也为猪、羊等家畜精液冷冻保存提供理论依据,也对X、Y性控精液的差异蛋白质组学研究具有重要的理论与现实意义。
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