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研究背景：
苯丙胺类物质是一组具有类似化学结构的中枢神经系统兴奋剂,包括苯丙胺(amphetamine,AMP)、甲基苯丙胺(methamphetamine,MA,俗称冰毒)、亚甲基二氧甲基苯丙胺(MDMA,俗称摇头丸)及其它一些精神兴奋剂。90年代以来,苯丙胺类中枢兴奋剂(amphetamine-type stimulants,ATS)滥用增长势头迅猛,呈全球蔓延之势。专家们预测,ATS将成为21世纪最广泛滥用的药物,甲基苯丙胺和亚甲基二氧甲基苯丙胺将是其中最常被滥用的物质。
药物依赖是一种长时程的生物学效应(long term signaling molecularadaptation)。cAMP反应元件结合蛋白和即刻早期基因如c-Fos、c-jun等是目前研究药物依赖的主要的两类细胞核内转录因子。谷氨酸(glutamate)是哺乳动物中枢神经系统内最主要的兴奋性神经递质,其受体类型包括N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体、α-氨基羟甲基异恶唑丙酸(alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid,AMPA)受体、红藻氨酸(kainilacid,KA)受体等,其中NMDA与AMPA受体在药物依赖形成过程中起着十分重要的作用。药物依赖是一种由滥用药物与大脑奖赏系统相互作用产生的慢性、复发性脑疾病,其中伏隔核与下丘脑与ATS依赖关系密切。
我们在前期研究中发现,钩藤碱能够消除大鼠在苯丙胺诱导下形成的位置偏爱；使苯丙胺引起的大鼠脑内氨基酸类神经递质含量改变恢复至正常水平；对苯丙胺引起的大鼠伏隔核及杏仁核中NR2B蛋白的表达上调有抑制作用；对苯丙胺引起的大鼠神经核团中NR2B mRNA表达的改变有抑制作用,且钩藤碱本身无精神依赖性。钩藤生物碱的这些特点表明它对防治药物成瘾是一个具有显著研究价值和应用前景的天然药物。
研究目的：
条件性位置偏爱(conditioned place preference,CPP)实验是一种通过测定动物对以前体验药物效应的位置是否产生偏爱,从而评价药物精神依赖性潜力的有效方法,也可用于研究药物依赖性的神经生物学机制等。目前关于药物精神依赖的研究,多集中于中枢神经递质如多巴胺(dopamine,DA)和谷氨酸(glutamate,Glu)等,而对于核内转录因子的变化则少有研究。因此,本课题将行为学和分子机制结合起来研究,拟建立大鼠的甲基苯丙胺CPP动物模型,用行为学方法观察大鼠CPP效应,并应用免疫组织化学法测定大鼠不同脑区c-Fos和p-CREB蛋白表达情况,从而探讨其在药物精神依赖分子机制中的作用以及钩藤碱对其的影响。
谷氨酸受体与药物依赖关系密切,关于NMDA受体与药物依赖关系的报道比较常见,AMPA受体在药物依赖形成过程中也起着十分重要的作用,但相关报道较少。本课题拟建立甲基苯丙胺条件性位置偏爱模型,采用蛋白免疫印迹(Western blotting)方法,研究甲基苯丙胺条件性位置偏爱大鼠伏隔核及下丘脑中AMPA受体表达的改变及中药活性成分钩藤碱对其的干预作用,为阐明AMPA受体与甲基苯丙胺成瘾的关系,及钩藤碱调节甲基苯丙胺依赖的具体机制提供实验证据。
结论
1.甲基苯丙胺能使受试动物产生明显的位置偏爱效应,大鼠于伴药箱中停留时间明显延长。低剂量(30mg/kg)钩藤碱可以一定程度上缩短成瘾大鼠在伴药箱中的停留时间,但效果不显著；而高剂量(60mg/kg)钩藤碱可显著抑制甲基苯丙胺大鼠依赖状态下的CPP效应,使之与正常大鼠无显著差异。而正常大鼠给予钩藤碱(60mg/kg)并不会产生CPP,说明钩藤碱本身并无成瘾性。
2.甲基苯丙胺CPP大鼠海马CA1区和纹状体中p-CREB及c-Fos阳性细胞数显著增加,低剂量(30mg/kg)钩藤碱对其改变无影响,而高剂量(60mg/kg)钩藤碱可显著抑制这种改变,使p-CREB及c-Fos阳性细胞数回复正常。
3.甲基苯丙胺成瘾会使正常大鼠伏隔核内GluR2/3亚基蛋白表达显著上调；而下丘脑内GluR2/3亚基蛋白表达显著下调。低剂量(30mg/kg)钩藤碱对此种改变不能起明显作用,而高剂量(60mg/kg)钩藤碱可显著抑制这种改变,使GluR2/3亚基蛋白的改变趋于正常水平。
注:本论文中的所有数据均采用SPSS 13.0进行分析。所有数据以(x±s)表示,各组大鼠在伴药箱中的停留时间比较采用单向方差分析(One-Way ANOVA),各组均数的多重比较采用最小显著差值法(least significant different,LSD)；不满足方差齐性要求是,采用Dunnetts T3法。同组大鼠给药前后在伴药箱中的停留时间比较采用配对t检验(Paired-Samples T Test)。各组大鼠给药后p-CREB和c-Fos阳性细胞数的比较均采用单向方差分析(One-Way ANOVA),Westernblotting结果以每张转印膜上目的蛋白条带光密度值与相应内标actin条带相比后,进行单因素方差分析。显著性水平P<0.05。