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乳腺癌是继肺癌之后，全球发病率最高的癌症。乳腺癌的死亡率位居癌症死亡率的第五位，是威胁女性身体健康的主要杀手。无论是乳腺癌还是其他类型的癌症，血管生成对于实体瘤的生长和转移都是至关重要的。通过血管生成，肿瘤不但获得了营养，排出了代谢废物，而且为肿瘤进一步向远端转移提供了机会。 在众多影响血管生成的因子中，血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor, VEGF)是一种非常重要的促进血管新生的因子。VEGF是具有肝素结合活性的碱性蛋白质。它被高度糖基化，两个相同的亚基以二硫键相交联结合在一起。VEGF不仅在胚胎发育、维持血管稳定性以及促进骨骼肌肉分化等正常生理进程中发挥作用，而且也参与到多种病理性的血管形成过程中。癌症研究证实，VEGF与肿瘤细胞的生长、浸润和转移过程密切相关。 在脊椎动物中，转录因子ZEB1是ZEB家族成员之一。它是一类E-box结合锌指蛋白。ZEB家族成员具有共同的结构特点:蛋白的N端和C端各有一个C2H2锌指结构域，中间为同源结构域。ZEB1通过其N端和C端的锌指结构簇与被调控基因启动子区的E-box结合发挥转录抑制功能。ZEB1在乳腺癌的多个调控关键环节发挥重要作用，但有关ZEB1对于乳腺癌血管生成的调控机理尚未见详细报道。 在本研究中，我们检测了ZEB1对于乳腺癌血管生成的潜在功能，应用体内体外模型探究了其作用机理。为了研究ZEB1在乳腺癌血管生成中的潜在作用，我们成功构建了ZEB1稳定表达的MDA-MB-231细胞株。用空载体对照MDA-MB-231细胞和ZEB1稳定转染MDA-MB-231细胞的浓缩条件培养基分别处理事先接种于Matrigel上的人脐带血管内皮细胞HUVEC，观察两种条件培养基对HUVEC细胞血管形成能力的影响。血管形成实验检测发现，与对照组相比，稳定表达ZEB1的MDA-MB-231细胞株的浓缩条件培养基具有更加显著地促进HUVEC细胞血管形成的作用。因此，我们认为ZEB1可能是通过促进血管生成相关因子的表达和分泌发挥作用的。为了进一步验证上述观点，我们利用RT2profiler PCR array（Human Angiogenesis）检测了ZEB1对于一系列与血管生成功能相关基因表达的影响。RT2profiler PCR array的实验结果显示，在乳腺癌MDA-MB-231细胞中，ZEB1可以特异性地促进VEGFA基因的表达。 随后，我们在MDA-MB-231细胞中瞬时转染了人ZEB1的表达质粒，利用Quantitative PCR、Western Blot和ELISA检测了ZEB1对VEGFA表达和分泌的影响。实验结果显示，ZEB1能够特异性地上调VEGFA mRNA和蛋白的表达，促进细胞分泌更多的VEGFA蛋白。 VEGFA可以通过多条信号通路发挥作用。因此，我们检测了参与调控ZEB1促进VEGFA表达的信号通路途径。在MDA-MB-231细胞中，瞬时转染人ZEB1表达质粒，加入不同信号通路的特异性抑制剂（PI3K、NF-κB和MAPKs等信号通路特异性的信号通路抑制剂）。应用Q-PCR、Western Blot和ELISA检测了不同信号通路特异性的抑制剂对VEGFA表达和分泌的影响。实验结果显示，ZEB1通过p38和PI3K信号通路途径特异性地促进VEGFA的表达和分泌。 更进一步，我们分别构建了2.1K、1.6K、1.0K和0.5K四个不同截短长度的VEGFA启动子-荧光素酶报告基因质粒，用于研究ZEB1促进VEGFA转录的分子机制。将ZEB1和上述不同截短长度的VEGFA启动子-荧光素酶报告基因质粒共同瞬时转染MDA-MB-231细胞，检测ZEB1对各质粒荧光素酶活性的影响。Luciferase实验结果显示，ZEB1可以显著地上调VEGFA各启动子活性，而ZEB1对各启动子活性的影响无统计学差异。我们认为ZEB1对VEGFA转录激活的调控范围在VEGFA的-550/+34之间。结合文献报道，Sp1结合位点在维持VEGFA启动子活性方面具有重要作用。通过转录因子结合位点预测软件预测，VEGFA启动子-150/+1之间的Sp1结合位点是ZEB1作用的潜在位点。应用定点突变技术，我们构建了Sp1结合位点突变的0.5K VEGFA启动子-荧光素酶报告基因质粒。Luciferase检测ZEB1对0.5K野生型和突变型VEGFA启动子活性的影响。实验结果显示，Sp1结合位点对于维持VEGFA启动子活性至关重要，它的突变削弱了ZEB1对VEGFA启动子活性的促进作用，ZEB1通过VEGFA启动子上的Sp1结合位点激活其转录。与此同时，Q-CHIP实验进一步证实，ZEB1能够促进Sp1募集到VEGFA的启动子，增强VEGFA基因的转录活性。 为了进一步验证以上实验结论，我们又在128例人乳腺癌组织临床标本中，利用免疫组织化学IHC检测了ZEB1、VEGFA和CD31的表达情况。IHC结果显示，ZEB1主要表达在肿瘤的间质细胞核，在癌细胞的胞浆和少数病例的胞核中也有表达。根据ZEB1表达部位的不同，统计分析了ZEB1与VEGFA、ZEB1与CD31的表达相关性。统计结果显示，ZEB1与VEGFA以及ZEB1与CD31的表达均呈现明显的正相关性。 综上所述，本研究证明在乳腺癌中，ZEB1可以特异性地促进VEGFA的表达和分泌，诱导肿瘤细胞的血管生成。ZEB1对血管生成的调控作用，为进一步改进乳腺癌的临床治疗方案提供了前期理论依据。