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目的:
近年来我国老年人口比例不断上升，人口老龄化已成趋势，随之而来的神经系统退行性疾病患者数量也逐年上升。帕金森病(Parkinsons disease, PD)作为一种严重危害老年患者身体健康和生存质量的神经系统退行性疾病，已成为近年来神经病学领域的研究热点。中医药在治疗PD上有其特有的优势和疗效，然其作用机制尚不明确。近年来随着中医理论及中医药在细胞自噬领域的研究的不断推进，越来越多的研究表明以中药干预自噬-溶酶体途径调节调节细胞自噬功能或或可解释中药治疗PD等神经退行性疾病的作用机理。本研究拟采用6-羟基多巴胺(6-OHDA)单点注射法制备的PD大鼠模型为研究对象，观察“补肾法”对PD大鼠模型中脑黑质神经细胞内自噬相关蛋白Beclin1、P62、LC3Ⅱ表达的影响及各组大鼠行为学变化，探究“补肾法”(龟羚帕安丸)是否能够通过修复、疏通自噬-溶酶体降解途径受损节点，以延缓PD进展，从而阐明自噬这一机体自我保护机制可能是该法治疗PD的重要物质基础，为临床开展PD治疗工作提供一种新的方法和思路。
方法：
选用体重180-220g的SPF级，SD雄性大鼠90只，常规喂养一周后。采用单点法在SD大鼠右侧中脑黑质致密部坐标距前囟中心后-5.0mm距前囟中心左右-1.7mm、距脑膜表面深度-7.6mm钻孔并注射24μg6-OHDA，来建立PD大鼠模型，手术后1周，采用盐酸阿朴吗啡(APO)腹腔注射对造模大鼠进行行为学检测。随机选取50只造模成功的PD模型，称重，按照随机数字表法分为中药高、中、低剂量组、美多芭组和模型组5组，每组10只，再选取10只正常大鼠仅进行备皮、头皮切开、颅骨钻孔、头皮缝合等与造模同等手术操作处理，不予注射6-OHDA溶液诱导造模，作为假手术对照组。按照既定方案分组进行药物灌胃。分别在给药前及给药30天后对各组大鼠进行一般情况记录和行为学检测；于灌胃30天后取材，HE染色观察对比用药后大鼠中脑黑质组织损伤情况；免疫组化法检测大鼠中脑黑质致密部Beclin1、P62及LC3Ⅱ蛋白的表达；统计方法：结果若满足正态分布且方差齐则采用单因素方差分析；若不满足则采用多个独立样本非参数检验Kruskal-Wallis检验。
结果：
1.采用单点法在SD大鼠右侧中脑黑质致密部坐标距前囟中心后-5.0mm、距前囟中心左右-1.7mm、距脑膜表面深度-7.6mm钻孔并注射24μg6-OHDA，创建PD大鼠模型，56只大鼠造模成功，成功率为70%。
2.一般情况观察，给药后中药高、中、低及美多芭组大鼠精神、活动、毛发、饮食等情况均较模型组有所改善，随着给药时间的延长，其PD症状逐渐减轻。
3.LSD检验法检验大鼠旋转圈数差值比(K)，中药组高、中、低三种剂量(K)值都更高(P＜0.01)，证明，改善PD大鼠症状，中药组效果更为明显。
4.HE染色显示：假手术组中脑黑质神经元细胞数量密集，排列整齐，形态正常，没有明显损伤；模型组神经元细胞出现较为明显的损伤；中药组给药30天后神经元损伤情况较模型组有所改善，其中中药中等剂量组神经元数量最多，改善最为明显；美多芭组较模型组也有所改善，但改善情况不及中药中等剂量组。
5.中药高、中、低剂量组Beclin1的表达均高于模型组，差异明显(P＜0.01)；各中药组组间相较，Beclin1的表达中药中等剂量组最高，低剂量组最低，高剂量组高于低剂量组但不及中等剂量组，差异明显(P＜0.01)，说明中药龟羚帕安丸具有提高PD大鼠模型Beclin1表达的作用，作用明显，其改善PD大鼠Beclin1表达情况的作用与用药剂量有关，中等剂量(1.8 g/Kg/d)效果更为明显。
6.中药高、中、低剂量组P62蛋白的表达均低于模型组，差异显著(P＜0.01)；各中药组组间相较，低剂量组P62的表达最高，中等剂量组最低，高剂量组较中等剂量组高但不及低剂量组，差异显著(P＜0.01)。说明，中药龟羚帕安丸具有降低PD大鼠模型P62蛋白蓄积的作用，效果显著，其作用效果与用药剂量有关，中等剂量(1.8 g/Kg/d)效果更为明显。
7.中药高、中、低剂量组LC3Ⅱ的表达均明显较模型组高(P＜0.01)；中药组组间比较，中等剂量组最高，低剂量组最低，高剂量组较低剂量组高但不及中等剂量组，差异显著(P＜0.01)，说明中药龟羚帕安丸具有提高PD大鼠模型LC3Ⅱ表达即提高自噬体数量的作用，作用明显，其作用效果与用药剂量有关，中等剂量(1.8 g/Kg/d)效果更为明显。
结论：
采用中脑黑质致密部单点注射6-OHDA建立PD大鼠模型，便捷高效，成功率较高。“补肾法”(龟羚帕安丸)可有效改善PD大鼠的症状，疗效确切，且中剂量给药改善更为明显。“补肾法”干预PD大鼠模型可有效提高PD大鼠中脑黑质Beclin1及LC3Ⅱ表达，降低P62的蓄积。“补肾法”有效治疗PD的作用机制与疏通自噬-溶酶体降解途径，提高细胞自噬活性，改善细胞自身稳态有关。
近年来我国老年人口比例不断上升，人口老龄化已成趋势，随之而来的神经系统退行性疾病患者数量也逐年上升。帕金森病(Parkinsons disease, PD)作为一种严重危害老年患者身体健康和生存质量的神经系统退行性疾病，已成为近年来神经病学领域的研究热点。中医药在治疗PD上有其特有的优势和疗效，然其作用机制尚不明确。近年来随着中医理论及中医药在细胞自噬领域的研究的不断推进，越来越多的研究表明以中药干预自噬-溶酶体途径调节调节细胞自噬功能或或可解释中药治疗PD等神经退行性疾病的作用机理。本研究拟采用6-羟基多巴胺(6-OHDA)单点注射法制备的PD大鼠模型为研究对象，观察“补肾法”对PD大鼠模型中脑黑质神经细胞内自噬相关蛋白Beclin1、P62、LC3Ⅱ表达的影响及各组大鼠行为学变化，探究“补肾法”(龟羚帕安丸)是否能够通过修复、疏通自噬-溶酶体降解途径受损节点，以延缓PD进展，从而阐明自噬这一机体自我保护机制可能是该法治疗PD的重要物质基础，为临床开展PD治疗工作提供一种新的方法和思路。
方法：
选用体重180-220g的SPF级，SD雄性大鼠90只，常规喂养一周后。采用单点法在SD大鼠右侧中脑黑质致密部坐标距前囟中心后-5.0mm距前囟中心左右-1.7mm、距脑膜表面深度-7.6mm钻孔并注射24μg6-OHDA，来建立PD大鼠模型，手术后1周，采用盐酸阿朴吗啡(APO)腹腔注射对造模大鼠进行行为学检测。随机选取50只造模成功的PD模型，称重，按照随机数字表法分为中药高、中、低剂量组、美多芭组和模型组5组，每组10只，再选取10只正常大鼠仅进行备皮、头皮切开、颅骨钻孔、头皮缝合等与造模同等手术操作处理，不予注射6-OHDA溶液诱导造模，作为假手术对照组。按照既定方案分组进行药物灌胃。分别在给药前及给药30天后对各组大鼠进行一般情况记录和行为学检测；于灌胃30天后取材，HE染色观察对比用药后大鼠中脑黑质组织损伤情况；免疫组化法检测大鼠中脑黑质致密部Beclin1、P62及LC3Ⅱ蛋白的表达；统计方法：结果若满足正态分布且方差齐则采用单因素方差分析；若不满足则采用多个独立样本非参数检验Kruskal-Wallis检验。
结果：
1.采用单点法在SD大鼠右侧中脑黑质致密部坐标距前囟中心后-5.0mm、距前囟中心左右-1.7mm、距脑膜表面深度-7.6mm钻孔并注射24μg6-OHDA，创建PD大鼠模型，56只大鼠造模成功，成功率为70%。
2.一般情况观察，给药后中药高、中、低及美多芭组大鼠精神、活动、毛发、饮食等情况均较模型组有所改善，随着给药时间的延长，其PD症状逐渐减轻。
3.LSD检验法检验大鼠旋转圈数差值比(K)，中药组高、中、低三种剂量(K)值都更高(P＜0.01)，证明，改善PD大鼠症状，中药组效果更为明显。
4.HE染色显示：假手术组中脑黑质神经元细胞数量密集，排列整齐，形态正常，没有明显损伤；模型组神经元细胞出现较为明显的损伤；中药组给药30天后神经元损伤情况较模型组有所改善，其中中药中等剂量组神经元数量最多，改善最为明显；美多芭组较模型组也有所改善，但改善情况不及中药中等剂量组。
5.中药高、中、低剂量组Beclin1的表达均高于模型组，差异明显(P＜0.01)；各中药组组间相较，Beclin1的表达中药中等剂量组最高，低剂量组最低，高剂量组高于低剂量组但不及中等剂量组，差异明显(P＜0.01)，说明中药龟羚帕安丸具有提高PD大鼠模型Beclin1表达的作用，作用明显，其改善PD大鼠Beclin1表达情况的作用与用药剂量有关，中等剂量(1.8 g/Kg/d)效果更为明显。
6.中药高、中、低剂量组P62蛋白的表达均低于模型组，差异显著(P＜0.01)；各中药组组间相较，低剂量组P62的表达最高，中等剂量组最低，高剂量组较中等剂量组高但不及低剂量组，差异显著(P＜0.01)。说明，中药龟羚帕安丸具有降低PD大鼠模型P62蛋白蓄积的作用，效果显著，其作用效果与用药剂量有关，中等剂量(1.8 g/Kg/d)效果更为明显。
7.中药高、中、低剂量组LC3Ⅱ的表达均明显较模型组高(P＜0.01)；中药组组间比较，中等剂量组最高，低剂量组最低，高剂量组较低剂量组高但不及中等剂量组，差异显著(P＜0.01)，说明中药龟羚帕安丸具有提高PD大鼠模型LC3Ⅱ表达即提高自噬体数量的作用，作用明显，其作用效果与用药剂量有关，中等剂量(1.8 g/Kg/d)效果更为明显。
结论：
采用中脑黑质致密部单点注射6-OHDA建立PD大鼠模型，便捷高效，成功率较高。“补肾法”(龟羚帕安丸)可有效改善PD大鼠的症状，疗效确切，且中剂量给药改善更为明显。“补肾法”干预PD大鼠模型可有效提高PD大鼠中脑黑质Beclin1及LC3Ⅱ表达，降低P62的蓄积。“补肾法”有效治疗PD的作用机制与疏通自噬-溶酶体降解途径，提高细胞自噬活性，改善细胞自身稳态有关。