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棉花黄萎病是由轮枝菌引起的一种真菌性维管束病害，可造成棉花的大量减产，由于缺乏有效抗源，至今对棉花黄萎病仍无有效的防治措施。从分子水平上明确棉花黄萎病菌致病相关基因的作用机理，可为提高棉花抗黄萎病基因工程提供理论依据。
本论文以大丽轮枝菌为研究对象，在优化农杆菌介导遗传转化体系的基础上，构建了一个包含11000个转化子的T-DNA插入突变体库。利用生测进行筛选，最终获得了2个毒力明显下降的突变体。为进一步分析T-DNA标签基因的作用机理，利用YADE技术对T-DNA标签基因进行克隆，获得了一个可能和毒力相关的基因。获得的主要研究结果如下:
1.农杆菌介导遗传转化体系的建立、优化及T-DNA突变体库的构建
利用潮霉素抗性基因hgy为筛选标记基因，绿色荧光蛋白基因GFP为报告基因，构建了用于大丽轮枝菌遗传转化的表达载体，并通过农杆菌介导法将其成功的导入大丽轮枝菌。对转化条件的优化的结果表明，最佳的转化步骤为:1）利用IM液体培养基调整农杆菌AGL-1浓度至OD600=0.2，于200rpm/28℃旋转摇床避光诱导4h。2）将等体积的AGL-1菌液和浓度为105个孢子/ml的大丽轮枝菌孢悬液混合。3）取100μL混合液涂布于覆盖有硝酸纤维素膜的IM固体培养基上，26℃共培养48h。4）将硝酸纤维素膜转移到含有500mg/L头孢霉素和50mg/L潮霉素的PDA琼脂平板上进行抗性筛选。根据上述优化的转化条件，获得潮霉素抗性转化子的几率为300～900个转化子/106个孢子。随机选取潮霉素抗性转化子，进行体视镜荧光观察，发现大多数转化子在紫外光激发下都能检测到绿色荧光;提取转化子基因组DNA扩增GFP基因，大多数转化子均能得到预期大小的目的片段，这些结果表明，报告基因GFP已被成功导入大丽轮枝菌。为利用T-DNA标签技术分离鉴定大丽轮枝菌中的一些致病相关基因，我们根据优化的转化体系，构建了一个含有11000个转化子的T-DNA插入突变体库。
2.生物测定及致病相关T-DNA标签基因的克隆
从构建的大丽轮枝菌T-DNA随机插入突变体库中，我们筛选了微菌核数量明显减少或生长缓慢的突变体进行了生物测定，结果发现编号为2810和7139这两个突变体对棉花的侵染能力明显下降。利用YADE方法，获得了7139突变体中T-DNA标签基因的部分序列。分析表明该片段对应的cDNA长为2556bp，编码一段含有851个氨基酸的肽链，BLAST比对表明该肽链为功能未知蛋白VDAG_00015的部分序列，因此将该基因命名为VdAG，推测该基因可能和致病相关。
3.VdAG基因的功能分析
为进一步分析VdAG基因的生物学功能，我们构建了该基因的敲除载体，通过已经优化的农杆菌介导法，将该载体导入大丽轮枝菌野生型菌株，基因敲除转化子的筛选和验证正在进行。