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京尼平是一种天然生物交联剂,具有广阔的应用前景。在自然界,京尼平含量很低,主要以其前体京尼平苷的形式存在。目前制备京尼平主要有直接提取法、化学催化法、微生物细胞转化法、β-葡萄糖苷酶转化法,酶转化法转化效率高、副反应少,制备的京尼平纯度很高,但是酶的成本高,不利于推广应用。本实验室前期筛得一株黑曲霉菌株B2,并初步研究了其β-葡萄糖苷酶的性质,发现转苷能力很强,因此本实验将已筛选得到的黑曲霉B2的β-葡萄糖苷酶基因bgll克隆,并在毕赤酵母中进行异源表达,以构建β-葡萄糖苷酶高产菌株,并对重组酶性质、和对酶转化京尼平苷条件的研究。结果如下:(1)黑曲霉B2的β-葡萄糖苷酶基因bgll的克隆:提取黑曲霉菌株B2的菌丝体的RNA,利用RT-PCR,克隆到β-葡萄糖苷酶基因bgllA和bgllB,其中bgllB含有一段内含子序列。(2)β-葡萄糖苷酶基因bgllA和bgllB在毕赤酵母中的表达:分别将bgllA和bgllB与带有α-factor信号肽的真核表达载体pPICZαA构建成重组表达载体pPICZα-bgll A和pPICZα-bgllB,利用电转化法将重组载体导入毕赤酵母GS115中,筛选得到整合有bgllA的1号转化子和整合有bgllB的2号转化子。30℃下用1%的甲醇诱导产酶,发现发酵液上清酶活较低,进行机械破碎酵母细胞没有发现胞内酶活,而在酵母细胞的悬浮液和机械破碎后的细胞碎片中发现酶活,初步判定,重组酶与细胞壁相结合。(3)将发酵液浓缩后进行蛋白性质分析:BGL1A的最适温度为50℃,最适pH为4.2,50℃下保温60min残余酶活为46.93%,在pH 3—6下稳定;BGL1B的最适温度为60℃,最适pH为4.4,50℃下保温60min残余酶活为63.03%,在pH 3—6下稳定。(4)用发酵液离心后的上清和酵母细胞悬液对京尼平苷进行酶解,用薄层层析法对酶解产物进行分析:发酵液离心后的上清对京尼平苷的转化作用较弱,整合有bgllB的细胞悬液120min内将京尼平苷完全水解。