论文部分内容阅读
第一部分SA脂质体介导人白介素-10基因(hIL-10)转染对大鼠局灶脑缺血再灌注损伤保护作用的研究目的:1.观察SA脂质体介导人IL-10基因转染在大鼠局灶脑缺血再灌注损伤中的转染效果。2.观察SA脂质体介导人IL-10基因转染对大鼠局灶脑缺血再灌注损伤保护作用。方法:84只大鼠随机分为4组:正常对照组(12只),缺血对照组(24只),hIL-10基因转染组(24只)和空质粒组(24只)。采用Longa法建立大鼠局灶脑缺血再灌注损伤模型(MCAO)。正常对照组不做任何操作;缺血对照组仅做MCAO模型和立体定向操作,不注射任何药物;hIL-10基因转染组和空质粒组在建立MCAO模型后,采用立体定向方式分别将SA脂质体/pcDNA3.1-IL-10混合物或SA脂质体/pcDNA3.1混合物注射入大鼠侧脑室内。各组大鼠在缺血2小时,拔出栓线,造成再灌注损伤。除正常对照组外,缺血对照组,IL-10基因转染组和空质粒组根据实验需要,分别在再灌注后24小时(1 d),72小时(3 d),168小时(7 d)处死部分大鼠,收集标本,进行检测。采用RT-PCR技术检测各组大鼠脑组织中hIL-10mRNA的表达;采用ELISA技术检测各组大鼠脑组织与血清中hIL-10蛋白的表达情况。另外同时采用光镜下观察海马CA1区神经元的形态学变化,TTC染色测定脑梗死体积和神经行为学评分来观察hIL-10基因转染对大鼠局灶脑缺血再灌注损伤的影响。结果:1.RT-PCR结果:hIL-10基因转染组大鼠在缺血再灌注72小时(3 d)时,其皮层和海马中均能检测到hIL-10mRNA的表达,而正常对照组,缺血对照组和空质粒组中则不能检测到hIL-10mRNA。2.ELISA结果:基因转染后24小时(1 d)脑组织中hIL-10即明显升高, 72小时(3 d)较24小时(1 d)更高,但到168小时(7 d)时已明显下降,但仍高于缺血对照组和空质粒组对应数值。血清中的hIL-10的含量变化与脑组织中类似,但其绝对数值则明显低于脑组织中的含量。3.HE染色,光镜观察显示,正常对照组海马组织结构正常,CA1区锥体细胞排列整齐,形态正常,细胞着色均匀,胞浆呈淡红色,胞核呈蓝色且较清亮。缺血对照组海马组织结构明显异常,CA1区锥体细胞排列紊乱,细胞间隙增宽,神经元变性明显。部分退变的神经元呈现凋亡特征:细胞皱缩成圆形或卵圆形;核染色质固缩、边集或碎裂;胞浆皱缩,嗜酸性增加。部分神经元亦出现胞浆红染、胞核固缩、溶解等坏死特征。hIL-10基因转染组CA1区神经细胞排列略紊乱,可见细胞皱缩和胞核固缩浓染现象,但程度较缺血对照组组明显减轻。4.行为学评分:缺血对照组,空质粒组和hIL-10基因转染组其行为学评分分别为(2.3±0.5)分、(2.2±0.6)分、和(1.7±0.4)分。结果显示,与缺血对照组、空质粒组比较,hIL-10基因转染可以明显降低实验大鼠的行为学评分(P﹤0.05),而空质粒组与缺血对照组之间无显著差异(P>0.05)。5.脑梗死体积:缺血对照组,空质粒组和hIL-10基因转染组其脑梗死区体积分别为(107.2±6.1)、(105.3±5.2)和(85.1±4.3)mm~3。提示hIL-10基因转染组脑梗死体积较缺血对照组﹑空质粒组明显缩小(P﹤0.05),而空质粒组与缺血对照组比较,脑梗死体积无明显变化(P>0.05)。结论:1.pcDNA3.1-IL-10在大鼠体内具有较强的表达能力,转染后能较长期分泌hIL-10。SA脂质体具有较强的传递基因的能力。2. hIL-10基因转染能减轻大鼠局灶脑缺血再灌注损伤。第二部分hIL-10基因转染对大鼠局灶脑缺血再灌注损伤后脑组织和血清中炎症因子基因和蛋白表达的影响目的:观察hIL-10基因转染对大鼠局灶脑缺血再灌注损伤脑组织中TNF-α和IL-1β基因和蛋白及血清中两种炎症因子水平的变化,来探讨其缺血脑保护的作用机制。方法:24只大鼠随机分为4组:正常对照组,缺血对照组,hIL-10基因转染组和空质粒组,每组6只。采用Longa法建立大鼠局灶脑缺血再灌注损伤模型(MCAO)。正常对照组不做任何操作;缺血对照组仅做MCAO模型和立体定向操作,不注射任何药物;hIL-10基因转染组和空质粒组在建立MCAO模型后,采用立体定向方式分别将SA脂质体/pcDNA3.1-IL-10混合物或SA脂质体/pcDNA3.1混合物注射入大鼠侧脑室内。缺血2小时,再灌注72小时处死,收集标本。分别采用荧光实时定量PCR技术检测各组大鼠脑组织中TNF-αmRNA和IL-1βmRNA的表达情况。同时采用ELISA法检测脑组织和血清中TNF-α和IL-1β蛋白的含量。结果:1. PCR结果显示,缺血对照组,空质粒组和hIL-10基因转染组,其TNF-αmRNA的表达水平较正常对照组均有明显升高,但hIL-10基因转染组的升高水平较缺血对照组和空质粒组显著下降(P﹤0.01)。同样IL-1βmRNA的表达水平在缺血对照组,空质粒组和hIL-10基因转染组中均较正常对照组明显升高,但hIL-10基因转染组的升高水平较缺血对照组和空质粒组显著下降(P﹤0.01)。2. ELISA结果提示,脑组织中TNF-α和IL-1β的含量在缺血对照组,空质粒组和hIL-10基因转染组中均较正常对照组明显升高,但在hIL-10基因转染组中的含量较缺血对照组和空质粒组明显降低(P﹤0.01)。缺血对照组,空质粒组和hIL-10基因转染组血清中IL-1β的含量较正常对照组明显升高,但IL-10基因转染组中的含量则明显低于缺血对照组和空质粒组(P﹤0.01)。而TNF-α在缺血对照组,空质粒组和hIL-10基因转染组中的含量明显高于正常对照组(P﹤0.01),但在这三组之间并无差异(P>0.05)。结论:hIL-10基因转染后,能抑制大鼠局灶脑缺血再灌注损伤后脑组织中和血清中炎症因子TNF-α和IL-1β的表达,可能是其发挥缺血脑保护作用的机制之一。第三部分hIL-10基因转染对大鼠局灶脑缺血再灌注损伤后脑组织中NO,SOD,MDA,GSH-Px的影响目的:观察hIL-10基因转染对大鼠局灶脑缺血再灌注损伤脑组织中NO,SOD,MDA,GSH-Px的影响,探讨其缺血脑保护的作用机制。方法:24只大鼠随机分为4组:正常对照组,缺血对照组,hIL-10基因转染组和空质粒组,每组6只。采用Longa法建立大鼠局灶脑缺血再灌注损伤模型(MCAO)。正常对照组不做任何操作;缺血对照组仅做MCAO模型和立体定向操作,不注射任何药物;hIL-10基因转染组和空质粒组在建立MCAO模型后,采用立体定向方式分别将SA脂质体/pcDNA3.1-IL-10混合物或SA脂质体/pcDNA3.1混合物注射入大鼠侧脑室内。在缺血2小时,再灌注72小时断头取脑,制成脑组织匀浆,分别采用比色法和TBA荧光法方法检测脑组织中NO,SOD,MDA,GSH-Px的含量。结果:正常对照组,缺血对照组,空质粒组和hIL-10基因转染组SOD的含量分别为214.28±13.73 U/mgprot, 170.69±12.26 U/mgprot, 175.20±13.76 U/mgprot和195.77±13.20 U/mgprot。与正常对照组相比,缺血对照组,空质粒组和hIL-10基因转染组SOD的含量明显下降(P﹤0.01)。hIL-10基因转染组SOD的含量则较缺血对照组,空质粒组明显升高(P﹤0.01)。缺血对照组和空质粒组之间无显著差异(P>0.05)。正常对照组,缺血对照组,空质粒组和hIL-10基因转染组GSH-Px的含量分别为25.73±1.72 U/mgprot, 19.91±1.81 U/mgprot,19.32±1.37 U/mgprot和22.70±2.22 U/mgprot。与正常对照组相比,缺血对照组,空质粒组GSH-Px的含量明显下降(P﹤0.01)。hIL-10基因转染组GSH-Px的含量则较缺血对照组,空质粒组明显升高(P﹤0.01)。缺血对照组和空质粒组之间无显著差异(P>0.05)。正常对照组和hIL-10基因转染组之间也无显著差异(P>0.05)。正常对照组,缺血对照组,空质粒组和hIL-10基因转染组MDA的含量分别为6.29±0.33 nmol/mgprot,8.75±0.44 nmol/mgprot,8.66±0.51 nmol/mgprot和7.70±0.31 nmol/mgprot。与正常对照组相比,缺血对照组,空质粒组和hIL-10基因转染组MDA的含量明显升高(P﹤0.01)。hIL-10基因转染组MDA的含量则较缺血对照组,空质粒组显著下降(P﹤0.01)。缺血对照组和空质粒组之间无显著差异(P>0.05)。正常对照组,缺血对照组,空质粒组和hIL-10基因转染组NO的含量分别为1.07±0.11μmol/gprot, 1.87±0.18μmol/gprot, 1.93±0.33μmol/gprot和1.44±0.10μmol/gprot。与正常对照组相比,缺血对照组,空质粒组和hIL-10基因转染组NO的含量明显升高(P﹤0.01)。hIL-10基因转染组NO的含量则较缺血对照组,空质粒组显著下降(P﹤0.01)。缺血对照组和空质粒组之间无显著差异(P>0.05)。结论:hIL-10基因转染能降低大鼠局灶脑缺血再灌注损伤脑组织中MDA和NO的含量,同时能提升SOD和GSH-Px的含量,可能是其发挥缺血脑保护作用的机制之一。第四部分hIL-10基因转染对大鼠局灶脑缺血再灌注损伤后脑组织钠氢交换器-1(NHE-1)基因表达的影响目的:观察hIL-10基因转染对大鼠局灶脑缺血再灌注损伤脑组织NHE-1mRNA和NF-κB mRNA的影响,探讨其缺血脑保护的作用机制。方法:24只大鼠随机分为4组:正常对照组,缺血对照组,hIL-10基因转染组和空质粒组,每组6只。采用Longa法建立大鼠局灶脑缺血再灌注损伤模型(MCAO)。正常对照组不做任何操作;缺血对照组仅做MCAO模型和立体定向操作,不注射任何药物;hIL-10基因转染组和空质粒组在建立MCAO模型后,采用立体定向方式分别将SA脂质体/pcDNA3.1-IL-10混合物或SA脂质体/pcDNA3.1混合物注射入大鼠侧脑室内。在缺血2小时,再灌注72小时时断头取脑,提取总RNA,然后转录成cDNA,采用荧光实时定量PCR技术观察各组大鼠脑组织中NHE-1mRNA和NF-κB mRNA的表达水平。结果:(1)正常对照组,缺血对照组,空质粒组和hIL-10基因转染组,其NF-κB mRNA的表达量分别为1.00±0.33,3.26±0.39,3.53±0.39和1.97±0.34。与正常对照组相比,其它三组NF-κB mRNA的表达量均显著升高(P﹤0.05),但hIL-10基因转染组的升高水平较其它两组明显下降(P﹤0.05)。缺血对照组和空质粒组相比无显著差异(P﹥0.05)。(2)正常对照组,缺血对照组,空质粒组和hIL-10基因转染组,其NHE-1 mRNA的表达量分别为1.00±0.22,3.57±1.08,3.16±0.89和1.77±0.17。与正常对照组相比,NHE-1 mRNA的表达量均显著升高(P﹤0.05),但hIL-10基因转染组的升高水平较其它两组明显下降(P﹤0.05)。缺血对照组和空质粒组相比无显著差异(P﹥0.05)。结论:hIL-10基因转染能抑制脑缺血再灌注损伤大鼠NHE-1 mRNA的表达,可能是其发挥缺血脑保护作用的机制之一。