西氏鲍与皱纹盘鲍杂交子代抗逆性分子机制的初步研究

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在鲍遗传育种工作中,杂交是一种行之有效的改良养殖种质的手段,通过杂交获得的杂种后代,与亲代相比往往具有生长快、存活率高、抗逆性强等方面的杂种优势。为研究这种杂种优势的分子机制,本研究以西氏鲍(Haliotis gigantea)(GG)、皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)(DD)及其正交F1代群体(DG)和反交F1代群体(GD)为研究对象,探讨了它们在应对温度骤变、短期温度胁迫和病菌胁迫等不利环境时,一些耐热及免疫相关分子指标的变化和差异,以期初步了解鲍种间杂种优势的分子机制,同时试图筛选可能用于鲍育种实践的分子指标。   利用RACE技术从西氏鲍(Haliotis gigantea)中克隆到了热休克蛋白70(HSP70)、热休克蛋白90(HSP90)和铁蛋白(Ferritin)的核苷酸全长序列,从皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)中克隆到了冷休克结构域蛋白(CSDP)的核苷酸全长序列。其中西氏鲍HSP70、HSP90和Ferritin的全长分别为2449bp、2608bp和909bp,分别编码448、501和117个氨基酸;皱纹盘鲍CSDP的全长为1468bp,可编码202个氨基酸。由核苷酸序列推断出的西氏鲍HSP70、HSP90、Ferritin和皱纹盘鲍CSDP的氨基酸序列,各自均具有其家族的标志性序列。氨基酸序列的同源性比对显示,西氏鲍HSP70、HSP90和Ferritin的氨基酸序列与其它贝类的HSP70、HSP90和Ferritin高度相似,皱纹盘鲍CSDP的氨基酸序列的保守区(CSD)序列与其它水生动物的CSDP保守区氨基酸序列高度相似。   以半定量PCR为手段研究了在梯度温度应激下,HSP70和HSP90在四群体中的表达情况。实验结果表明,在非应激温度下,GG具有最高的HSP70和HSP90水平;在应激温度下,DD的HSP70和HSP90水平呈现先上升后下降的趋势,GG、DG和GD的HSP70和HSP90水平均随温度上升而上升;在相对高温的30℃条件下,DD的HSP70和HSP90水平显著低于其它三个群体。结果表明,DG和GD明显地继承了GG的耐高温能力,表现出杂种优势或中亲优势。   将四个群体分别置于低温(12℃)和高温(28℃)下进行持续7天的短期胁迫,在胁迫的开始和结束时(1天和7天)分别测定四个群体的免疫参数指标(总血细胞数THC,呼吸爆发RO,四种溶酶体酶SOD、ACP、AKP和MPO的活力)及耐热性评价指标(HSP70)的水平。结果表明,在不同取样时间点,鲍的整体THC水平在28℃下均有显著上升,且DG和GD的整体THC水平要显著高于DD和GG; RO水平和SOD活力在不同群体间没有显著差异,28℃下,RO水平显著地增加,而SOD活力则呈现先上升,后下降的趋势;AKP活力在12℃和28℃下均有显著提高(第1天),且DG的整体AKP水平要显著高于其它三个群体;而ACP活力在7天的胁迫过程中没有显著变化;MPO活力能够被12℃和28℃显著抑制(第1天),而在第7天恢复本底值,且DG和GD的整体MPO活力显著低于DD和SS(第1天),而在第7天时各群体间的MPO水平没有显著差异;四个群体的整体HSP70的表达均能被高温显著诱导,DD的HSP70水平在高温胁迫的第1天急剧增加,而在第7天又急剧下降,GG、DG和GD的HSP70水平则在7天的高温胁迫过程中缓慢上升。实验的结果表明,所选用的免疫参数均能被高低温显著影响;在不同温度条件下,DG和GD的免疫指标水平和HSP70水平或是高于DD,或是在面对胁迫时波动不明显,预示着相对于DD,杂交群体在胁迫温度下有着更强的耐热力和更高的免疫系统效率。   以哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)三株弧菌的混合菌为侵入菌,分别对四个群体进行常温(20℃)和高温(28℃)下的攻毒,并观察四个群体在攻毒后48h内的存活率差异;同时以半定量PCR法研究了常温(20℃)攻毒后,四个群体的两种组织(鳃和血淋巴)内的三种免疫相关基因:HSP70、CSDP和Ferritin在48h内的表达规律及差异。存活率实验表明,在常温下四个群体均没有出现死亡的情况,而在高温下四个群体均出现了明显的死亡:在48h时,DD群体全部死亡;在12h到48h的时间内,GG、DG和GD三群体的存活率均高于DD群体。半定量PCR结果显示,HSP70在鲍的鳃和血淋巴中均有显著上调,且呈现时间依赖性,分别在攻毒后的48h和12h时达到最高值,且GG、DG和GD三个群体的整体HSP70水平要显著高于DD群体;CSDP在鲍的鳃组织中表达规律呈明显的时间依赖性,在48h时达到最高值,并且DD群体的CSDP水平显著低于其它三个群体;Ferritin在鲍的鳃组织和血淋巴中均随病菌胁迫表现出规律性的上调,但总体上在四个群体间没有显著差异。以上实验结果表明,DG和GD已经通过杂交继承了GG的强抗病力,通过杂交实现了对皱纹盘鲍的种质改良。
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