论文部分内容阅读
新城疫是由新城疫病毒强毒株感染引起的一种禽类急性、高度接触性传染病,对世界范围内的禽类养殖业危害极大。目前尽管本病在我国已经得到了有效控制,但病原体仍存在于一些地区,并且近年有新基因型新城疫病毒的出现,为了解病原体的分布和病原学特征,进一步防控和消灭本病,本研究对部分地区的病原进行了监测和遗传演化分析,建立了两种能够快速鉴别新城疫强毒株的方法,对分离到的流行毒株进行了检测。1.2016-2017年我国部分地区新城疫病毒病原学监测2016-2017年在我国部分地区开展了新城疫流行病学调查与病原学分析。共收集3647份样品,分离到62株新城疫病毒。2016年分离到了 46株新城疫病毒,27株来自鸡、14株来自鸭、4株来自鹅、1株来自鸽;2017年分离到16株新城疫病毒,11株来自鸡、3株来自环境样品、2株来自鸽。对F基因部分片段测序后进行遗传演化分析,结果表明:62株新城疫病毒分离株中有39株属于Ⅰ类3型、13株属于Ⅱ类Ⅱ型、3株属于Ⅱ类基因Ⅵ型、1株为Ⅱ类基因Ⅶ型、6株NDV为国内新出现的Ⅰ类的未确定基因型病毒。Ⅰ类基因3型和Ⅱ类Ⅱ型NDV为2016-2017年我国这些地区的优势基因型。为进一步了解新基因型毒株及部分地区NDV优势基因型毒株的病原学特征,选取了 1株Ⅰ类基因3型、1株Ⅱ类基因Ⅱ型、4株新基因型分离株进行了 F基因扩增与同源性分析,同源性分析结果显示Ⅰ类3型毒株与我国3型分离株同源性较高、Ⅱ类Ⅱ型分离株与La Sota同源性为99.9%、4株新基因毒株同源性高于97.9%。4株新基因型毒株的F蛋白裂解位点均为112E-RR-Q-E-R-L117符合新城疫病毒弱毒的裂解位点序列,均有12个半胱氨酸和6个糖基化位点,与其他Ⅰ类新城疫病毒的F蛋白功能区比较均未出现蛋白替换。利用F基因高变区建立系统进化树结果显示:这4株毒株与Ⅰ类1-10型的bootstrap<75,遗传关系较远,不能归属为Ⅰ类1-10型,为Ⅰ类新基因分型毒株,利用F基因编码区全长序列构建系统进化树发现这4株毒均属于基因1c亚型,与北美分离株同源关系更近。为进一步了解我国新基因型毒株的基因组特征,选取了宁夏分离株duck/Ningxia/2209/2016(以下简称为NX2209)进行基因组扩增,基因组全长为15198 nt,同源性分析结果显示,NX2209属于Ⅰ类新城疫病毒。2.新城疫病毒强弱毒双重RT-PCR方法的建立及应用分别设计了 1对强毒和1对弱毒的引物,建立了可区分NDV强毒和弱毒的一步法双重RT-PCR方法,对新城疫病毒强毒可以扩增出353 bp和228 bp的双条带,弱毒仅可以扩增出一条353 bp的单条带。灵敏性试验和特异性试验结果表明,该方法可检测到的最低核酸拷贝数为1.1×105和1.7×105,能够检测到的最低RNA的浓度为0.02 pg/μL;使用9种临床常见的禽类病毒(禽流感病毒(H5亚型、H7亚型、H9亚型)、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡减蛋下降综合征病毒、禽脑脊髓炎病毒、禽网状内皮组织增生症病毒)进行扩增均未出现特异性条带;使用该双重RT-PCR与本实验室以前建立的快速鉴别Ⅰ类和Ⅱ类新城疫病毒的多重RT-PCR方法、国标中鉴定NDV的方法对2017年718份临床样品进行平行试验对照,该方法的诊断方法敏感性为98.36%,特异性为97.0%,优于另外2种方法。测序结果显示,本研究建立的双重RT-PCR方法阳性符合率为90.54%。3.新城疫强毒NASBA检测方法的建立及应用通过引物筛选和条件优化成功建立了新城疫强毒的NASBA检测方法,灵敏性试验表明能够检出的核酸最低为5个拷贝数,此时RNA的浓度为7.24×10-7 pg/μL;特异性试验表明该方法对7株禽类常见的病毒(H5亚型禽流感病毒、H7亚型禽流感病毒、H9亚型禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、禽脑脊髓炎病毒)未扩增出特异性条带;选取53份样品使用NASBA方法和新城疫病毒强弱毒双重RT-PCR方法进行平行试验比较,该方法的诊断方法敏感性为97.22%,特异性为94.11%,优于RT-PCR方法。测序结果显示,NASBA的阳性符合率为97.22%,优于RT-PCR方法。