论文部分内容阅读
目的：本文旨在通过体内、体外细胞实验,对比热解炭涂层炭／炭复合材料(C/C+Pyc)、纯钛(Ti)、羟基磷灰涂层炭/炭复合材料(C/C+HA)三者的细胞毒性的情况及对成骨细胞粘附进行评价、以及三种材料对成骨细胞活性、增殖和分化能力的影响和脱落粉末无表面改性炭炭材料比较表面改性涂层炭炭复合材料植入体内粉末脱落情况,同时,该实验探索炭炭涂层材料作为新型体内植入物的可行性。本课题主要研究用电子显微镜扫描(SEM)、X射线衍射分析仪(XRD)研究了纯钛、羟基磷灰涂层炭/炭复合材料、热解炭涂层炭/炭复合材料三种材料的表面形貌的组成。为进一步的临床应用研究提供前期实验基础,也为C/C表面改性涂层材料作为新型体内植入物的可行性提供一定的实验依据。方法：本课题主要实验根据中华人民共和国国家标准GB/T16886.1-2001的规定,按照外科植入物的生物相容性评价项目进行评价。1.选取12只新西兰大白兔,将脱落粉末无表面改性炭炭材料、解炭涂层炭/炭复合材料两种材料,分别植入臀中肌内,分别观察2、4、8周通过HE染色对以上材料观察粉末脱落程度。2.人的成骨细胞传代培养,待细胞传代培养几乎稳定后,将三种不同金属实验材料与成骨细胞置于一起培养。3.将本课题实验金属材料分成三组,A组(纯钛TI)为阴性对照组；B组HA涂层C/C复合材料(C/C+HA)为阳性对照组；C组热解炭涂层炭／炭复合材料(C/C+Pyc)为实验组各40片,先通过超声波清洗,后用灭菌备用。4.采用人的额骨成骨细胞-AM+PI+DAPI染色试剂的荧光染色对培养细胞染色、采用MTT法对成骨培养细胞的活性测定,来综合整体评价三种材料对人额骨成骨细胞的粘附与增殖影响。5.采用人的额骨成骨细胞肌动蛋白(actin)+β微管蛋白+DAPI的免疫荧光染色、额骨成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性功能的测定,来综合评价细胞的分化与成熟。6.采用RT-PCR检测人的额骨成骨细胞Ⅰ型胶原蛋白BMP-2、OSTC mRNA表达的相对变化量、同时对各种材料表面的细胞生长通过扫描电镜观察得出结果,来整体评价额骨成骨细胞成骨钙化的能力。7.数据用x±s表示,采用SPSS18.0统计分析软件对实验数据进行分析,各实验组组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVE),多个样本均数间的多重比较采用LSD-t检验。P<0.05有统计学差异。结果：1.通过HE染色观察以上两种植入体内材料全部在体内原来位置,术中见脱落粉末的无表面改性炭炭材料仍出现严重炭粉脱落,表面改性的热解炭炭/炭涂层复合材料通过加工处理后植入体内可见炭粉脱落情况明显好转。2.人的额骨成骨细胞-AM+PI+DAPI的荧光染色、MTT法成骨细胞活性测定：随着材料-成骨细胞培养时间的延长,B、C各组材料与A组材料相比更有利于人的额骨成骨细胞的增殖,具有统计学意义(P<0.05)；B、C两组材料对人额骨成骨细胞的毒性相差不是很大,没有统计学意义(P>0.05)。3.采用人的额骨成骨细胞肌动蛋白(actin)+β微管蛋白+DAPI的免疫荧光、对人额骨成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性功能测定：随着材料-成骨细胞培养时间的增加,B、C各组材料与A组材料相比更有利于细胞的分化与成熟,具有统计学意义(P<0.05)；B、C两组材料之间对细胞的分化与成熟的作用相差不大,没有统计学意义(P>0.05)。4.采用RT-PCR测定人的额骨成骨细胞Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达量的变化、通过扫描电镜对各组材料表面成骨细胞进行观察,表明：B、C组材料比A组材料仍具有更强的成骨钙化能力,促使成骨细胞钙化,有统计学意义(P<0.05)；对B、C两组材料促使成骨钙化能力比较,两者促使成骨钙化能力相差不大,没有统计学意义(P>0.05)。结论：热解炭C/C涂层复合材料通过表面改性后对人额骨成骨细胞无明显毒副作用,与羟基磷灰石涂层C/C复合材料相比对促进成骨细胞增殖、成骨钙化、生物相容性等方面接近,为热解炭C/C涂层复合材料将来作为临床的新型生物植入材料提供了前期的实验依据和理论基础。