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目的探讨改良型富含血小板纤维蛋白(Advanced platelet-rich fibrin,A-PRF)对人骨髓间充质干细胞(Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,HBMSCs)体外增殖及成骨分化的影响。方法在体外无菌条件下采集人骨髓血,根据干细胞易贴附于塑料底物的特性培养人骨髓间充质干细胞。细胞传代至第三代,通过细胞流式仪技术检测细胞来源,利用茜素红染色法鉴定细胞是否具有成骨分化潜能。A-PRF的制备:于志愿者肘静脉处采血10 mL,离心后获取A-PRF纤维蛋白凝块,放置于完全培养液中备用。含有不同浓度A-PRF的培养基培养细胞后采用噻唑蓝(methylthiazolyl diphenyltetrazolium bromide,MTT)法检测不同浓度A-PRF对人骨髓间充质干细胞的促增殖效应并筛选出促进细胞增殖的最佳浓度。含有10%A-PRF浓度的不同条件培养基培养细胞后分别采用碱性磷酸酶法(Alkaline phosphatase,ALP)、茜素红染色法检测A-PRF对人骨髓间充质干细胞不同时期的体外成骨分化的影响,采用实时荧光定量聚合酶链氏反应法(Quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测成骨特异性转录因子(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、骨形成蛋白2(Bone Morphogenetic Protein 2,BMP-2)以及I型胶原蛋白(Collagen type I,Alpha 1,Col1A1)等相关基因的表达。结果1.体外获得、培养的细胞经如下鉴定证明为人骨髓间充质干细胞:免疫表型鉴定结果:CD44及CD90阳性表达率分别为94.99%和98.48%,CD34及CD45阴性表达率分别为0.41%和0.31%,说明所培养的细胞来源于骨髓间充质;成骨诱导液培养21 d茜素红染色后于倒置荧光显微镜下可见大量钙结节,证明所培养的细胞具有成骨分化的潜能。2.MTT结果显示:在第1 d时不同浓度A-PRF对细胞促增殖作用不明显,各组的平均吸光度值之间无差异;第3 d各实验组的平均吸光度值明显高于对照组(p<0.05);在第5 d、7 d各实验组与对照组的平均吸光度之间具有显著性统计学差异(p<0.01),A-PRF对细胞的促增殖能力越来越明显并且呈现剂量依赖性,尤其以含有10%A-PRF浓度促增殖作用最为显著。3.ALP结果显示:在第7 d时含有10%A-PRF浓度的完全培养液组的ALP值明显高于完全培养液组(p<0.01),并且含有10%A-PRF浓度的成骨诱导液组的ALP值明显高于成骨诱导液组(p<0.01)。同时,随着时间的增长,ALP活性值逐渐升高,在第14 d时含有10%A-PRF浓度的各实验组ALP值显著高于相对应对照组(p<0.01)。结果表明,A-PRF可以促进骨髓间充质干细胞早期成骨。4.茜素红染色结果显示:正常培养液(10%A-PRF)组染色深于正常培养液组。显微镜下可见前者大多数长梭形干细胞变为短梭形成骨细胞,后者仅有少数细胞发生细胞形态转变,经过钙结节的半定量分析表明前者钙结节数目明显多于后者。成骨诱导培养液(10%A-PRF)组较成骨诱导液组染色深,显微镜下钙结节的半定量分析也证实上述结果。5.qRT-PCR结果显示:正常培养液(10%A-PRF)组与正常培养液组相比,上调Runx2、ALP、BMP2及Col1A1的表达,差异具有统计学意义(p<0.05)。与成骨诱导液组相比,成骨诱导培养液(10%A-PRF)组明显提高Runx2、ALP、BMP2及Col1A1的表达,差异同样具有统计学意义(p<0.05)。结论1.全骨髓直接贴壁法是一种体外获得和培养人骨髓间充质干细胞相对简便、高效的方法。2.A-PRF可以促进人骨髓间充质干细胞体外增殖及其成骨分化,当A-PRF与HBMSCs相结合时,在促进骨缺损修复再生方面具有较大的临床应用潜能。