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慢性疼痛又被称为“不死的癌症”,具有病程长且难以治愈的严重危害。慢性疼痛的长期折磨给患者的身心健康和生活质量都带来了严重的危害,患者为治疗慢性疼痛付出了沉重的经济代价。伴随着近年来细胞及分子研究技术的不断提高,有关慢性疼痛发病机制的研究也取得了很大进展,外周及中枢敏化已被证实是导致慢性疼痛的最重要的神经学机制。但是由于对其发病的分子机制不够清楚,缺乏有效的诊断标准和治疗方案,目前治疗效果仍不乐观。临床上使用较多的止疼药还是仅限于阿片类和非甾体类两大类,由于非甾体类药物对于疼痛的治疗效果有限,所以不能作为一种广泛使用的镇痛药;而阿片类药物则更多是因为会导致精神上瘾、呼吸抑制、恶心呕吐等严重毒副作用,导致其使用受到了很大的限制。所以,研究慢性疼痛的起因和发病机理,对于帮助研究人员在疼痛治疗中寻找新靶点、探索新方法和制定新策略,具有重要的医学及社会意义。相关研究指出:环磷酸腺苷(c AMP)-蛋白激酶A(PKA)信号传导通路在神经病理性疼痛的形成过程中发挥了重要的作用,其不但介导了炎症介质引起的外周敏化,还参与了诸多神经病理性疼痛的调节途径。同时,也有研究指出:超极化激活环核苷酸门控阳离子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels,HCN)与神经病理性疼痛的发生密切相关。根据前期的文献报道,我们发现:c AMP-PKA与HCN都参与了炎性痛痛觉敏化的形成;另有报道指出:在多种生理活动中,HCN通道的激活都受到c AMP-PKA信号通路的调节。为此,我们进一步设计实验,通过应用动物行为学检测手段和分子生物学检测技术,探究c AMP-PKA信号通路与HCN通路是如何参与和介导炎性痛痛觉敏化的形成过程。第一部分探讨c AMP-PKA信号通路在正常生理状态下对基础痛阈的影响以及炎性病理状态下致痛觉敏化的作用目的:验证c AMP-PKA通路在生理状态下对基础痛阈的影响及炎性病理状态下致痛敏的作用。方法:选取WT组小鼠、PKA＿KO组小鼠及行鞘内注射c AMP-PKA激动剂Forsklin组小鼠各16只,按照不同组别随机分成两组,共六组;三组不同组别小鼠用于生理状态下的研究,另外三组不同组别小鼠用于炎性病理状态下的研究;通过对生理状态下WT小鼠、PKA＿KO小鼠及Forsklin小鼠机械痛阈值及热痛阈值的测定,来判断三组小鼠对机械刺激和热刺激的反应性是否不同;对另外三组小鼠的一侧后肢足底注射氟氏完全佐剂建立炎性痛敏模型,通过观察造模前(basal)及造模后的不同时点(6h、12h、24h、48h、96h)三组小鼠的机械痛阈和热痛阈阈值,判断在炎性痛病理状态下三组小鼠的机械痛敏和热痛敏情况是否具有差异。结果:正常生理状态下,与WT组小鼠相比,PKA＿KO组小鼠对机械刺激和热刺激的反应性明显下降,表现为PWTL值和PWMT值显著升高(P<0.001),而Forsklin组小鼠对机械刺激和热刺激的反应性明显升高,表现为PWTL值和PWMT值显著下降(P<0.001);重复测量方差分析结果显示:在注射完CFA后,三组小鼠均出现机械痛敏和热痛敏,表现为PWTL值和PWMT值显著下降(P<0.001);组间比较结果显示:在注射CFA后的不同时间点均发现PKA＿KO组小鼠的PWTL值和PWMT值明显大于WT组小鼠(P<0.001),而Forsklin组小鼠的PWTL值和PWMT值小于WT组小鼠(P<0.001)。结论:在生理状态下,c AMP-PKA信号传导通路在协同感受外界机械刺激和热刺激方面可能发挥着重要的作用;而在炎性痛病理状态下,c AMP-PKA信号传导通路在机械痛敏和热痛敏的形成过程中可能发挥更为重要的作用。第二部分探讨c AMP-PKA传导通路对正常生理状态下及炎性痛病理状态下DRG神经元的影响目的:验证c AMP-PKA通路在生理及炎性病理状态下对DRG神经元兴奋性的影响。方法:实验小鼠的来源与分组均同于第一部分,行为学测试结束后,将小鼠处死,进行DRG组织取材;利用全细胞膜片钳技术对各组小鼠DRG神经元细胞的主动膜特性(动作电位(AP)的基强度、频率、幅值、阈值及半宽)和被动膜特性(静息电位(RMP)、膜电阻(Rm)、膜电容(Cm))进行记录和分析。通过观察生理状态下及CFA注射24h后三组小鼠DRG神经元主、被动膜特性,来判断不同组别小鼠DRG神经元在不同状态下的兴奋性是否具有差异。结果:在生理状态下,三组小鼠DRG神经元的RMP、Rm、Cm值并无差异(P<0.05);而AP基强度和频率则存在显著差异,具体表现为与WT组小鼠相比,PKA＿KO组小鼠AP的基强度值显著增加,频率显著下降(P<0.01),Forsklin组小鼠AP的基强度值著显下降,频率显著增加(P<0.01);三组小鼠AP的幅值、阈值和半宽无差异(P<0.05)。CFA注射24h后,相比与生理状态下,三组小鼠DRG神经元的兴奋性均有明显增加,表现为AP的基强度明显下降,频率明显增加,差异有统计学意义(P<0.01);组间对比结果显示:相比于WT小鼠,PKA＿KO组小鼠AP的基强度明显增加,频率明显下降(P<0.01),Forsklin组小鼠AP的基强度明显下降,频率明显增加(P<0.01);三组小鼠间AP的幅值、阈值、半宽以及RMP、Rm、Cm均无显著性差异(P<0.05)。结论:c AMP-PKA信号传导通路对生理状态下DRG神经元的兴奋性以及炎性痛病理状态下DRG神经元的超兴奋状态可能产生重要的影响。第三部分研究c AMP-PKA信号传导通路在炎性痛痛觉敏化中对DRG神经元HCN通道的影响目的:验证c AMP-PKA信号通路在炎性痛痛觉敏化中是否参与了DRG神经元HCN通道的激活。方法:实验小鼠的来源、分组及组织取材方法均同于第二部分,在此不再赘述;分别利用蛋白质免疫印迹法(Western blot)和实时荧光定量PCR技术(q PCR)对生理及炎性痛病理状态下不同组别的小鼠进行HCN通道蛋白和基因的检测,通过观测两种状态下不同组别小鼠的HCN2通道蛋白和基因的表达水平,来验证c AMP-PKA信号传导通路在炎性痛痛觉敏化过程中是否参与了DRG神经元HCN通道的激活。结果:在生理状态下,与WT组相比,PKA＿KO组HCN2蛋白的表达量明显减少(P<0.05),HCN2-m RNA的表水平明显下降(P<0.01),而Forsklin组HCN2蛋白的表达量明显增加(P<0.05),HCN2-m RNA的表达水平明显升高(P<0.01);在炎性痛病理状态下,三组小鼠DRG中HCN2蛋白及HCN2-m RNA的表达水平均明显高于生理状态下(P<0.05,P<0.01);组间对比结果显示,与WT组相比,PKA＿KO组HCN2蛋白的表达量明显减少(P<0.05),HCN2-m RNA的表达水平明显下降(P<0.01),而Forsklin组HCN2蛋白表达量明显增加(P<0.05),HCN2-m RNA表达水平明显升高(P<0.01)。结论:1、相比于生理状态下,炎性痛病理状态下的小鼠DRG神经元中HCN2通道的开放明显增加且与c AMP-PKA的含量水平密切相关。2、HCN通道的激活可能参与介导了c AMP-PKA信号传导通路在炎性痛痛觉敏化中的信息传递。