论文部分内容阅读
目的：吉兰-巴雷综合征（GBS）是一种危害严重的急性周围神经病。其病因和发病机制还不完全清楚，目前认为与空肠弯曲菌（Cj）的前驱感染有关。不同国家不同实验室报道的有血清学证据有Cj感染的百分比相差甚远（7%～76%），但多数在30%左右。国外学者通过分析Cj-LPS的化学结构，与神经节苷脂的结构相比较，发现两者存在结构相同的部分，不同血清型可以模拟不同的神经节苷脂，其中Pennor O:19型Cj-LPS模拟神经节苷脂GM1。这提示在GBS发病中Cj-LPS抗体可能起很重要的作用。以往的研究是用患者的血清在组织培养中或神经外膜下注射，都可引起神经损伤。但患者血清可能含有多种抗体成分。本实验的第一部分用免疫亲和层析的方法纯化GBS患者血浆中的LPS抗体，观察LPS抗体是否与神经节苷脂交叉反应；以及LPS抗体在动物周围神经中的结合位点，以研究LPS抗体在GBS发病中所起作用。免疫网络学说认为抗体分子除具有与抗原结合的特性外，还具有自身免疫原性的独特型（idiotype, Id）,可激活淋巴细胞产生抗独特型抗体（anti-idiotypic antibody, AId）。自身免疫病的一个显著特征是存在大量自身抗体，从而导致发病。本实验的第二部分是制备抗LPS抗体的单克隆AId，利用这种Id-AId的特异关系，<WP=5>检测患者血清内是否存在相应的LPS抗体Id，从而判断GBS是否为Cj相关的，这就提供了一种不用Cj菌检测Cj相关GBS新检测方法。在组织学中可以用AId检测抗体Id的存在及定位。还可用来清除体内的LPS抗体，或在动物实验中做干预。方法：厌氧培养Pennor O:19型空肠弯曲菌，酚-水法提取LPS，DNase，RNase, Proteinase K消化混合物中的DNA，RNA及蛋白质。银染和考马斯亮蓝染色鉴定所提LPS纯度。LPS用包被稀释液稀释致10ug/ml，包被酶标板，2%牛血清白蛋白封闭，检测5位GBS患者血浆LPS抗体，选取LPS抗体阳性血浆。将Sepharose 4 Fast Flow介质装入柱中，用冰1mMHCl溶胀，少量，多次入柱，最后一次把HCl彻底放干净，防止残留的HCl影响下一部偶联过程的PH值。预先将LPS溶于偶联缓冲液中，立即将LPS溶液加入柱中，不断上下颠倒晃动，室温2～4h。Tris缓冲液多次少量入柱，以封闭介质中未被偶联的活性基团，室温2 h。Tris·HCl缓冲液和乙酸缓冲液反复交替入柱，以洗去结合不牢固的LPS。GBS患者（ELISA检测LPS抗体阳性）血浆用0.22um滤膜过滤，以除去颗粒性物质，防止堵塞介质的孔径。血浆入柱，为保证抗原抗体反应充分，保持缓慢流出。血浆过完后用PB缓冲液冲柱。这时血浆中的抗体被偶联在介质上的LPS所吸附。缓慢加入3MKSCN以解离吸附的抗体，收集解离液，每1ml收集一管，SDS-PAGE观察解离液中是否有抗体，合并有抗体的管，透析以去除KSCN。Brad Ford法测定LPS抗体的浓度。Western-blot<WP=6>鉴定LPS抗体与LPS结合。用神经节苷脂GM1包被酶标板，间接ELISA法检测LPS抗体与GM1的交叉反应的情况。免疫组织化学方法检测LPS抗体在动物周围神经上的结合位点，取正常S/D大鼠、Wistar大鼠和狗的坐骨神经，4%甲醛固定，常规方法制作石蜡切片，厚6um。3%H2O2消除内源性HRP，100ug/ml蛋白酶K抗原修复，10%小牛血清封闭。一抗用纯化的LPS抗体（1：50稀释）阴性对照用PBS。二抗用HRP-羊抗人IgG。DAB显色。本研究的第二部分是应用细胞融合技术制备抗LPS抗体独特型的单克隆抗体，并对所得单克隆抗进行进一步鉴定。6～8周的雌性BALB/C小鼠，初次免疫用LPS抗体溶液与等体积的完全氟氏佐剂超声混匀5min，使完全乳化，腹腔注射，0.5ml/只（含LPS抗体5ug）。间隔两周后加强一次，抗原与不完全氟氏佐剂混匀，10ug/只。末次免疫于融合前72h腹腔注射纯抗原10ug/只。融合前ELISA检测免疫动物血清效价，取免疫效价高的小鼠做融合。取骨髓瘤细胞和免疫脾细胞混合，在融合剂 PEG的作用下融合，融合细胞悬于HAT培养液中，分到预先培养饲养细胞的培养板中0.1ml/孔，37 ℃，5%二氧化碳培养箱中培养。待融合细胞长满孔底的1/3，取上清做ELISA，阳性孔以有限稀释法做克隆，一共进行3次，稳定传代3～4代后冻存。经反复筛选克隆得到5株分泌抗体的细胞株。对这5株单抗进一步鉴定。首先是单抗特异性的鉴定：采用间接ELISE法，用LPS抗体和正常人血清分别包被酶标板，分别检测上清的反应性，当结果为两种反应都阳性时我们认为这种单抗是抗人免<WP=7>疫球蛋白共同结构即恒定区；当结果为与LPS抗体反应阳性与人血清反应阴性时认为此单抗为抗可变区的抗体。接着又对这些抗可变区单抗进行进一步鉴定：交叉反应竞争抑制实验，以确定单抗是否能抑制LPS抗体与神经节苷脂GM1的交叉反应。采用间接ELISA法，用GM1包被酶标板，1：50稀释的LPS抗体与单抗上清混合，37℃孵育1h，加HRP-羊抗人IgG，OPD显色。中和抑制试验观察单抗是否能抑制其他GBS患者血浆中的LPS抗体与LPS反应，用LPS包被酶标板，1：100稀释的另一名GBS患者血浆与倍比稀释的单抗上清混合，37℃孵育1h，加HRP-羊抗人IgG，OPD显色。抑制率S=阳性值-试验值/阳性值-阴性值×100%。单抗与不同GBS患者LPS抗体反应性的鉴定：分别用单抗上清和LPS包被酶标板，加入1：100稀释的不同GBS患者血浆，加入HRP-羊抗人IgG，OPD显?