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研究目的：构建含Hepcidin基因重组腺病毒干扰真核表达载体Pad-hepc-shRNA-GFP,并验证其门静脉注射途径的干预效果。实验方法：1) Pad-hepc-shRNA-EGFP的构建：根据Hepcidin基因在genbank的序列,设计相应的siRNA,通过设计构架oligo,合成shRNA序列。设计并合成1对互补的含shRNA序列的寡聚单链DNA,按一定的体系退火形成DNA双链,然后用载体构建试剂盒BLOCK-iT U6RNAi Entry Vector Kit (invitrogen, Catalog nos. K4944-00)进行重组克隆,将退火而成的双链shRNA oligo插入shRNA表达载体pENTR/U6vector中,按照一定的连接体系,构建shRNA表达质粒,并转化至感受态细胞DH5a孵育,小量质粒抽提并且测序。设计引物、运用特定的酶切体系,对于构建的pENTR/U6载体进行改造,连入CMV启动子和荧光蛋白GFP,然后使用Invitrogen公司的LR重组系统将改造好的载体和pAd/BLOCK-IT-DEST重组,转化至感受态细胞DH5α孵育,筛选并测序,验证Pad-hpec-shRNA-EGFP(?)建成功。用构建的腺病毒载体Pad-hepc-shRNA-EGFP经Pac I消化后转染293A细胞,包装病毒,收集初级病毒液,二次扩增,收集病毒原液并测定滴度,备用。2)经小鼠门静脉注射干扰病毒：对正常balb/c小鼠麻醉后,行门静脉注射载体病毒量2.7109ifu/ml/500ul,正常喂养10d后,取肝脏标本,通过半定量PT-PCR法检测小鼠肝脏Hepcidin基因的表达情况。对照组取正常小鼠肝脏标本检测Hepcidin基因的表达情况。研究结果：经过基因测序证明,腺病毒重组载体Pad-hepc-shRNA-EGFP中包含的基因片段与目的基因一致,成功构建了含Hepcidin基因重组腺病毒干扰真核表达载体,经过包装、扩增,并获得了滴度为2.7109ifu/ml腺病毒液。病毒门静脉注射后,实验组小鼠肝脏Hepcidin mRNA表达为1.30±0.53,明显低于对照组(6.39±1.00),充分显示出了门静脉注射此载体能够对Hepcidin基因的有效的抑制。结论：门静脉注射Hepcidin基因特异性重组腺病毒干扰载体Pad-hepc-shRNA-EGFP能够有效抑制小鼠Hepcidin基因的表达。