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肾细胞癌(Renal Cell Carcinoma,RCC)是较常见的癌症,也是最致命的泌尿生殖系统肿瘤。然而,它不是一个单一的实体,而是多种肿瘤的集合,被认为是肾小管几个部分表型的再现,每个部分都有不同的组织学和遗传学特征。肾肿瘤与许多其他侵袭性或浸润性肿瘤不同,呈舌状微细延伸至肾静脉或肾窦,通常无纤维增生性或破坏性浸润反应。因此,与其他器官的癌症相比,肾细胞癌较不易被发现。深入了解肾脏解剖,对组织进行充分取样,并在大体检查和显微镜分析中对这些重要发现进行预测和仔细研究是较为重要的。NPM1属于组蛋白伴侣家族,核仁蛋白/核质蛋白(NPM)家族,包括多个主要功能成员(NPM1,NPM2,NPM3和无脊椎动物NPM),并且可以在所有多细胞动物中找到。虽然这个家族在功能上有很好的特征,但人们对这些基因和蛋白质的进化知之甚少。本研究旨在应用蛋白组学的方法研究肾透明细胞癌肿瘤组织与癌旁组织之间蛋白表达谱的差异,从而建立肾透明细胞癌的差异表达谱,目标是通过对部分蛋白的研究,进一步了解肾透明细胞癌发生发展的促进因子或抑制因子。我们从差异表达蛋白谱中选取NPM1作为目标蛋白,采用免疫印迹(Western Blot)的方法验证了其表达情况;免疫组化分析不同分化程度的肾透明细胞癌中蛋白NPM1的表达情况;构建NPM1过表达和低表达的稳转细胞株,观察RNA干扰NPM1基因的表达对肾透明细胞癌细胞786-O的增殖、侵袭及迁移的影响作用,从而进一步了解NPM1对肾透明细胞癌的影响。本研究共分为四部分第一部分:肾透明细胞癌组织与癌旁组织的差异蛋白谱的建立方法:1、选取10例肾透明细胞癌肿瘤组织标本及配对的癌旁正常组织标本作为研究对象。所用癌旁组织均取自癌组织上端,且距离癌组织均大于5厘米。所有患者术前均未接受任何化疗和放疗,且肿瘤组织标本术后均经病理学证实为肾透明细胞癌。术中切除的组织经PBS冲洗放入液氮速冻,再置于-80℃冰箱保存。2、提取肿瘤组织和癌旁组织中的总蛋白,并分析组织的蛋白质浓度。3、制备蛋白水解多肽混合物。4、采用二维液相色谱法进行样本的分离。5、通过LTQ XL离子阱质谱仪对二维色谱洗脱的多肽进行检测。6、对质谱数据进行生物信息学分析,找到癌组织与癌旁组织差异表达的蛋白质。结果:1、经二维色谱与质谱联用分析,在肾透明细胞癌组织标本中共获得了846个蛋白质点;癌旁组织中共获得了535个蛋白质点。将这些蛋白质点进行比对,并经数据库检索,发现癌组织与癌旁组织差异表达的蛋白质共有35个。2、在肿瘤组织中上调表达的20个蛋白质分别是:NPM1、AHNAK2、PDIA3、MCT4、Cyp A、SKP1、CA9、SCGN、KRT18、HAPLN2、TGM2、CPQ、ACY1、POSTN、PAH、FREM2、LAMA4、CSPG4、GBP1、RBP4。3、在肿瘤组织中下调表达的15个蛋白质分别是:C11ORF54、APOA4、SERPINA5、AGXT2、CHDH、NNT、ACE、ISCU、PRDX3、AK2、PNP、NPL、MRPL44、PHYH、GRHPR。4、通过本次研究我们建立了肾透明细胞癌组织和癌旁组织的差异表达蛋白谱,为进一步深入研究肾透明细胞癌的发病机制提供实验数据。5、从差异表达蛋白谱中选取NPM1作为目标蛋白进行后续研究。第二部分:NPM1差异表达的验证及其与相关临床病理资料信息的关系分析方法:1.选取10例原发性肾透明细胞癌组织标本和10例配对癌旁组织标本,用Western-blot的方法鉴定目标蛋白NPM1在肾透明细胞癌组织及癌旁组织中的表达情况。2.收集100例不同分期的肾透明细胞癌患者的病切片,免疫组化法观察蛋白NPM1的表达与患者分期的相关性。结果:1.在随机选取的10组肾透明细胞癌组织标本中,对比分析目标蛋白NPM1分别在肾透明细胞癌肿瘤组织及其配对的癌旁组织中的表达量,我们发现蛋白NPM1在肾透明细胞癌组织中上调表达。2.通过统计学分析,认为NPM1蛋白的表达可以提示与肿瘤的TNM分期(p<0.05)相关;然而NPM1蛋白的表达水平与患者性别、年龄无相关性(p>0.05)。第三部分:NPM1在肾透明细胞癌细胞株中的表达及其过表达对细胞生物功能的影响方法:1、制备NPM1过表达及低表达稳转单克隆细胞株。2、在荧光显微镜下观察质粒转染的肾透明细胞癌细胞786-O、NPM1-shRNA质粒转染的肾透明细胞癌细胞786-O内NPM1蛋白的表达情况。3、Western-blot及RT-PCR验证各组稳转细胞株中NPM1的基因水平及蛋白水平。4、观察质粒转染的肾透明细胞癌细胞786-O、NPM1-sh RNA质粒转染的肾透明细胞癌细胞786-O增殖侵袭、迁移的影响。结果:1、我们成功构建了NPM1过表达和低表达的稳转细胞株。2、我们通过观察肾透明细胞癌细胞786-O中,NPM1不同表达水平情况下细胞的生长能力,观察NPM1对肾透明细胞癌细胞的生物学行为的影响。观察细胞生长曲线,结果显示:与control组相比,NPM1过表达时,肾透明细胞癌细胞786-O生长能力明显增强(p<0.05),而NPM1表达降低时,肾透明细胞癌细胞786-O生长能力明显减弱(p<0.05)。3、我们通过观察肾透明细胞癌细胞786-O中,NPM1不同表达水平情况下细胞的迁移能力,观察NPM1对肾透明细胞癌细胞的生物学行为的影响。细胞迁移的结果显示:NPM1过表达时,肾透明细胞癌细胞786-O迁移能力明显增强(p<0.05),而NPM1表达降低时,肾透明细胞癌细胞786-O迁移能力明显减弱(p<0.05)4、我们通过观察肾透明细胞癌细胞786-O中,NPM1不同表达水平情况下细胞的侵袭能力,观察NPM1对肾透明细胞癌细胞的生物学行为的影响。NPM1过表达时,肾透明细胞癌细胞786-O侵袭能力明显增强(p<0.05),而NPM1表达降低时,肾透明细胞癌细胞786-O侵袭能力明显减弱(p<0.05)。第四部分:稳转细胞株在裸鼠中的成瘤情况方法:选取4周龄的SPF级裸鼠,将成功筛选的稳转细胞株经皮下注入到裸鼠体内,30天后统一处死,取出瘤体,量取肿瘤的大小并称重,Western-blot检测瘤体中蛋白NPM1的表达水平,分析蛋白NPM1不同表达水平下的瘤体之间的差异性。结果:1、各组肾透明细胞癌细胞786-O接种后第9天,即可在裸鼠皮下观察到肿瘤结节,随着时间的延长瘤体逐渐增大,触之较硬,与周围边界清晰。2、称重瘤体,结果显示NPM1-overexpressed组裸鼠瘤体平均重量明显高于control组(p<0.05);NPM1-sh RNA组裸鼠瘤体平均重量明显低于相应的control组(p<0.05)。3.我们应用Western-blot检测了裸鼠移植瘤组织内NPM1蛋白的表达情况,结果显示NPM1-overexpressed组中NPM1蛋白表达高于control组(p<0.05);NPM1-sh RNA组NPM1蛋白表达明显低于NC组(p<0.05)。通过以上研究,我们得出以下结论:1.二维色谱-质谱联用技术分析差异蛋白的结果,可用于对肿瘤中的差异蛋白的检测。2.肾透明细胞癌组织中NPM1的表达量显著高于癌旁组织;发现蛋白NPM1的表达与TNM分期相关。3.蛋白NPM1的表达对肾透明细胞癌细胞的增殖、侵袭与迁移均有促进作用。4.通过体内裸鼠成瘤实验,验证了体外实验中观察到的蛋白NPM1对肿瘤的增殖的促进作用。