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目的抑郁症是一种发病率较高的一种精神疾病,具有高致残性。在整个生命周期中,有15%以上的人群受到抑郁症的困扰,为家庭和社会带来了巨大的负担。目前有共识认为抑郁是基因与环境因素相互作用的结果,然而神经病理学机制仍不清楚。经典的单胺假说认为：5-HT、去甲肾上腺素、多巴胺等单胺神经递质的缺乏或不平衡是抑郁症发病的机制。虽然抗抑郁增强单胺系统效应的作用支持了这一假说,但是部分患者对抗抑郁药物反应不佳,而且一般在治疗几周或几个月后,药物临床疗效才出现。所以,单胺递质减少可能仅仅是导致抑郁症的起点机制。临床流行病学研究发现,生命早期遭受创伤事件的人群,成年抑郁症易感性增加。基础研究也发现,早年遭受应激的啮齿类动物,成年后有抑郁样行为。同时研究也发现,抑郁症患者存在海马结构异常,如海马萎缩,神经元体积缩小、神经元和神经胶质细胞密度减低等。近年来,大量研究已经证实,哺乳动物海马存在新生的神经元,这些新生神经元不断填补到海马齿状回中,维持海马的正常生理功能。因此,多个易感基因与环境因素影响下的大脑特殊结构的神经可塑性紊乱可能是抑郁症发病的原因。BDNF和CREB被认为对神经元的再生、存活、分化、生长发育起重要作用,有着防止神经元受损伤死亡、改善神经元病理状态、促进神经元再生及分化等生物效应,因此BDNF和CREB对维持中枢神经元的正常结构和生理功能具有重要的作用。BDNF和CREB的mRNA表达和蛋白水平降低将影响海马的神经再生等神经可塑性,影响海马的正常功能。研究还显示,海马BDNF和CREB的mRNA表达和蛋白水平会影响海马的神经可塑性,而海马神经的可塑性又可能与抑郁症的发病有关。其他研究显示,生命早期应激可以增加成年抑郁易感性。因此,我们推测生命早期应激会改变海马神经再生、BDNF和CREB的mRNA表达和蛋白,导致抑郁易感性增加。在后期不良环境因素的影响下,可能导致抑郁症的发生。为了论证我们的推测,本研究旨在探讨早年应激对成年大鼠海马神经再生、海马BDNFmRNA和蛋白、CREBmRNA和蛋白水平以及行为的影响；遭受早年应激的成年大鼠遭受慢性不可预见轻度应激时的行为和海马BDNFmRNA和蛋白CREBmRNA和蛋白水平的变化。方法1.分组健康成年雌雄SD大鼠合笼,交配繁殖下一代。幼鼠出生后,移去雄性大鼠,留下母鼠与新生幼鼠在一起。挑出新生雄性幼鼠分为下列4组：①正常对照组：出生后至第90天正常喂养;②MD组：出生后第2天至第14天,每天与母鼠分离3h,第15天开始正常喂养至第90天；③CUMS组：出生后至第90天正常喂养,而后给予21天的慢性轻度不可预见应激；④双重应激组：出生后第2天至第14天,每天与母鼠分离3h,第15天开始正常喂养至第90天,而后给予21天的慢性轻度不可预见应激。2.应激模型的建立①MD模型：大鼠于出生后的第2天至第14天每天接受3h的母亲分离。每天9：30把幼鼠从母鼠巢中移出,单独放置于干净的盒子中,底部铺垫母巢中的木屑,温度与母巢一致,12：30再把幼鼠移回母巢中。②CUMS模型：大鼠连续21天接受各种不同的不可预知的轻度应激：禁水(24h),禁食(48h),夹尾(1min),热刺激(45℃水浴,5min),明暗颠倒(24h),束缚(2h,2次),冰水游泳(4℃,5min)。每天采取的应激方式随意抽取。应激期间每只大鼠一个笼子孤养。3.行为观察①糖水偏好测验：试验前先禁水禁食24h,然后每只大鼠同时给予事先称重的2瓶水(一瓶为1%蔗糖水,另一瓶为自来水),60min后,取走2瓶进行定量,计算每只大鼠糖水偏爱百分比[糖水消耗量/(糖水消耗量+普通自来水消耗量)×100%]。糖水偏好降低反映快感缺乏,为抑郁症的核心症状之一。正常对照组、MD组在出生第90天进行糖水偏好测验,CUMS组和双重应激组在CUMS前后进行糖水偏好测验。②旷场测验：实验在一个安静的房间内进行,时间均在9：00--12：00进行,2次测试房间温度、湿度相同。动物的活动情况采用动物运动轨迹记录分析系统(Ethovision系统,荷兰Noldus公司)采集和分析。旷场为120cmx90cmx35cm铁质敞箱,底部平分为25个方格,外围16个方格视为外围场地,中间9个方格视为内围场地。实验于早9：0012：00进行。实验时手提大鼠尾巴将大鼠轻轻放在箱底中心方格内,电脑开始记时,摄像头记录大鼠10min的行为,包括总行程、内围场地行程、直立次数。总行程直接反映动物的兴奋程度,内围场地行程反映大鼠的焦虑水平,直立次数反映大鼠的探索能力。正常对照组、MD组在出生第90天进行旷场测验,CUMS组和双重应激组在CUMS后进行旷场测验。4. BrdU标记和免疫组化方法检测海马齿状回神经再生数量糖水偏好测验和旷场测验结束后第2天,对正常对照组(n=12),MD组(n=12)用BrdU标记和免疫组化方法检测海马齿状回神经再生的数量。①BrdU标记给大鼠腹腔注射BrdU (50mg/kg).每3h注射1次,共注射3次。24h后麻醉大鼠。经生理盐水和含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液灌注固定。断头后,取出脑组织并进行再固定和脱水、包埋存于-70℃低温冰箱。②免疫组化方法检测海马齿状回神经再生取出冰冻的大鼠脑组织,对其作连续冠状冰冻切片,每隔3张取1张切片组成1套；每套切片约5张,每片厚30μm,然后对上述切片,以BrdU小鼠单克隆抗体为一抗,生物素化小鼠抗体为二抗,进行免疫组化对海马齿状回BrdU标记细胞显色,并显微镜下计数。5. RT-PCR方法检测海马BDNFmRNA、CREBmRNA的表达水平正常对照组(n=12)、MD组(n=12)在糖水偏好测验和旷场测验结束后第2天以及CUMS组(n=12)和双重应激组(n=12)在CUMS后第2天断头,在冰冻铝盘上分离出海马,并储存在-70℃。样本化冻、粉碎,用逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)方法检测海马BDNF和CREB的mRNA表达水平。采用GAPDH作为内参,以测得样品BDNF和CREB产物值除以GAPDH值,最终得到的比值为BDNFmRNA和CREB mRNA的相对含量。6. Western blot方法检测海马BDNF和CREB的蛋白水平取标本方法同RT-PCR方法。使用兔单克隆抗CREB抗体和兔单克隆抗BDNF抗体,用考马斯亮蓝染色法标记。以β-actin蛋白表达水平作为内参,以各样本与相应内参灰度值比值为蛋白相对含量。结果1.MD对成年雄性大鼠行为和海马齿状回神经再生的影响的结果：(1)糖水偏好百分比,MD组明显少于正常对照组,差异具有统计学意义(P<0.01);(2)大鼠在旷场内10分钟行为：旷场总行程、内围场地行程、直立次数,MD组均明显少于正常对照组(P<0.05)。(3)MD组海马齿状回BrdU阳性细胞数明显少于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。2.MD对成年雄性大鼠行为和海马BDNFmRNA和蛋白、CREBmRNA和蛋白的影响的结果：(1)糖水偏好百分比,MD组明显少于正常对照组,差异具有统计学意义(P<0.01)：(2)大鼠在旷场内10分钟行为：旷场总行程、内围场地行程、直立次数,MD组均明显少于正常对照组(P<0.05)；(3) BDNF和CREB的mRNA表达及蛋白水平,MD组均明显低于正常对照组(P<0.05)。3.CUMS和双重应激对成年大鼠行为和海马BDNFmRNA和蛋白、CREBmRNA和蛋白的影响的结果：(1)糖水偏好百分比,母爱剥夺组、CUMS组、双重应激组明显低于正常对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);CUMS组低于双重应激组,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)大鼠在旷场内10分钟行为：旷场总行程、内围场地行程、直立次数,母爱剥夺组、CUMS组、双重应激组明显低于正常对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)：CUMS组低于双重应激组,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3) BDNFmRNA和CREBmRNA表达水平,母爱剥夺组、CUMS组、双重应激组明显低于正常对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);CUMS组低于双重应激组,差异具有统计学意义(P<0.05)。(4) BDNF蛋白和CREB蛋白水平,母爱剥夺组、CUMS组、双重应激组明显低于正常对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);CUMS组低于双重应激组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论(1)早年应激、成年慢性轻度应激和双重应激都可以影响行为和海马神经营养因子；(2)早年应激改变成年大鼠海马齿状回神经再生以及海马神经营养因子水平,使大鼠产生抑郁样行为,可能增加抑郁易感性；(3)早年应激改变成年后慢性轻度应激的行为反应和海马神经营养因子调节,导致对慢性轻度应激反应迟钝。(4)早年应激对海马产生的长期影响可能增加抑郁症易感性,抑郁的发病还需要进一步的环境因素。