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快速而准确地将丝状真菌鉴定至菌种水平对于侵袭性丝状真菌感染的正确治疗尤为重要。由于丝状真菌生长缓慢，形态学复杂等特点，实验室对于丝状真菌的快速病原学诊断比较困难。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser-Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS）技术通过检测微生物中的特异性蛋白而形成的特征性图谱进而达成对微生物菌种快速、准确的鉴定。可以通过优化MALDI-TOF MS对丝状真菌的鉴定条件达到快速而准确鉴定的效果。为明确质谱技术鉴定临床分离出的丝状真菌的最佳条件，本研究分别使用布鲁克公司的MALDI-TOF MS（型号为Microflex LT）质谱仪和CLIN-TOF Ⅱ MALDI-TOF MS对17个菌属共27个菌种的丝状真菌进行鉴定，同时评价了5种不同的实验条件对Microflex LT MALDI-TOF MS鉴定结果的影响。
我们对102株丝状真菌进行了分析，菌株分别于2011年1月至2017年12月，从解放军第三〇二医院和宁夏医科大学第一附属医院临床感染患者的送检标本中分离出。首先，将这些丝状真菌通过常规形态学方法和分子测序法鉴定至菌种的水平。然后，将分纯后的丝状真菌分别接种在沙保弱琼脂培养基和土豆琼脂培养基中之后分别在27℃和35℃两种温度下培养。在培养24、48、72、96、120、144和168h后分别通过直接涂抹法和甲酸-乙腈萃取法对丝状真菌的菌丝部位和分生孢子部位进行蛋白的提取。从而获得了不同的培养时间点、不同生长温度、不同提取方法、不同培养基和不同生长部位的特异性质谱指纹图谱。分子测序法作为鉴定的参考方法，其结果用于验证形态学方法和质谱鉴定法的准确度。
在所有菌株中，Microflex LT MALDI-TOF MS和CLIN-TOF Ⅱ MALDI-TOF均能够将84.3％的丝状真菌鉴定到菌种的水平，明显高于形态学方法（63.7％）。其中，Microflex LT MALDI-TOF MS对曲霉菌和镰刀菌的鉴定效果最好，菌种鉴定率分别达到了90.7％和100％。对单一因素的影响运用卡方检验进行数据分析，结果显示，除了生长部位外（χ2= 1.582，P= 0.174），其他四个因素对于Microflex LT MALDI-TOF MS鉴定结果的影响差异具有显著性意义（培养时间：χ2= 63.266，P= 0.000；培养基：χ2=4.036，P<0.045；培养温度：χ2= 10.923，P= 0.001；提取方法：χ2=13.013， P=0.000）。对于多因素的影响运用Logistic回归分析进行数据分析。结果表明，与Microflex LT MALDI-TOF MS鉴定效果相关的独立影响因素包括温度35℃（OR=1.018，P= 0.001）；培养时间48h （OR=1.033，P= 0.001）；甲酸-乙腈萃取法提取蛋白质（OR=1.169，P= 0.000）和沙保弱琼脂培养基（OR=1.090，P=0.044）。质谱法鉴定丝状真菌比传统方法节省至少24小时。此外，当我们把Microflex LT MALDI-TOF MS的菌种水平的cut-off值从≧2.0调整到≧1.7时，菌种鉴定率从75.6％提高到了95.6％，当cut-off值定在≧1.5时，菌种鉴定率达到了96.7%。本研究首次使用Microflex LT MALDI-TOF MS成功鉴定了赤曲霉菌，同时使用CLIN-TOF Ⅱ MALDI-TOFMS成功鉴定了共头霉菌。研究发现，Microflex LT MALDI-TOF MS和CLIN-TOF Ⅱ MALDI-TOFMS在鉴定时均无法区分黄曲霉菌和米曲霉菌。本研究首次报道了在提取丝状真菌DNA时的预处理方法并且取得了稳定的结果，所获DNA的A260/A280值在1.8~2.4之间，浓度在30~65ng/μl之间。
MALDI-TOF MS给丝状真菌的鉴定带来了前所未有的突破，具有操作简便、快速、鉴定正确率高的优越性，通过优化检测条件可进一步提高检测效率。但质谱指纹图谱数据库需要进一步丰富，对同源性高的真菌的鉴别还需要摸索条件，不断完善功能。
我们对102株丝状真菌进行了分析，菌株分别于2011年1月至2017年12月，从解放军第三〇二医院和宁夏医科大学第一附属医院临床感染患者的送检标本中分离出。首先，将这些丝状真菌通过常规形态学方法和分子测序法鉴定至菌种的水平。然后，将分纯后的丝状真菌分别接种在沙保弱琼脂培养基和土豆琼脂培养基中之后分别在27℃和35℃两种温度下培养。在培养24、48、72、96、120、144和168h后分别通过直接涂抹法和甲酸-乙腈萃取法对丝状真菌的菌丝部位和分生孢子部位进行蛋白的提取。从而获得了不同的培养时间点、不同生长温度、不同提取方法、不同培养基和不同生长部位的特异性质谱指纹图谱。分子测序法作为鉴定的参考方法，其结果用于验证形态学方法和质谱鉴定法的准确度。
在所有菌株中，Microflex LT MALDI-TOF MS和CLIN-TOF Ⅱ MALDI-TOF均能够将84.3％的丝状真菌鉴定到菌种的水平，明显高于形态学方法（63.7％）。其中，Microflex LT MALDI-TOF MS对曲霉菌和镰刀菌的鉴定效果最好，菌种鉴定率分别达到了90.7％和100％。对单一因素的影响运用卡方检验进行数据分析，结果显示，除了生长部位外（χ2= 1.582，P= 0.174），其他四个因素对于Microflex LT MALDI-TOF MS鉴定结果的影响差异具有显著性意义（培养时间：χ2= 63.266，P= 0.000；培养基：χ2=4.036，P<0.045；培养温度：χ2= 10.923，P= 0.001；提取方法：χ2=13.013， P=0.000）。对于多因素的影响运用Logistic回归分析进行数据分析。结果表明，与Microflex LT MALDI-TOF MS鉴定效果相关的独立影响因素包括温度35℃（OR=1.018，P= 0.001）；培养时间48h （OR=1.033，P= 0.001）；甲酸-乙腈萃取法提取蛋白质（OR=1.169，P= 0.000）和沙保弱琼脂培养基（OR=1.090，P=0.044）。质谱法鉴定丝状真菌比传统方法节省至少24小时。此外，当我们把Microflex LT MALDI-TOF MS的菌种水平的cut-off值从≧2.0调整到≧1.7时，菌种鉴定率从75.6％提高到了95.6％，当cut-off值定在≧1.5时，菌种鉴定率达到了96.7%。本研究首次使用Microflex LT MALDI-TOF MS成功鉴定了赤曲霉菌，同时使用CLIN-TOF Ⅱ MALDI-TOFMS成功鉴定了共头霉菌。研究发现，Microflex LT MALDI-TOF MS和CLIN-TOF Ⅱ MALDI-TOFMS在鉴定时均无法区分黄曲霉菌和米曲霉菌。本研究首次报道了在提取丝状真菌DNA时的预处理方法并且取得了稳定的结果，所获DNA的A260/A280值在1.8~2.4之间，浓度在30~65ng/μl之间。
MALDI-TOF MS给丝状真菌的鉴定带来了前所未有的突破，具有操作简便、快速、鉴定正确率高的优越性，通过优化检测条件可进一步提高检测效率。但质谱指纹图谱数据库需要进一步丰富，对同源性高的真菌的鉴别还需要摸索条件，不断完善功能。