论文部分内容阅读
目的:探讨肠球菌心内膜炎抗原efaA与肠球菌生物膜形成之间的相关性,为深入研究肠球菌生物膜的致病性及耐药性奠定基础。方法:1.利用普通光学显微镜观察efaA~+、efaA~-粪肠球菌在玻片上的生物膜形成过程,初步判定肠球菌生物膜形成各阶段的时间点;2.微量滴定板法比较efaA~+、efaA~-粪肠球菌的生物膜形成能力:细菌接种至96孔板中,培养不同时间后弃去培养液,结晶紫染色,乙醇-丙酮混合液溶解,酶标仪测定比较不同阶段efaA~+、efaA~-菌的OD570值;3. MTT法比较efaA~+、efaA~-粪肠球菌生物膜的活菌含量:细菌接种至96孔板中,培养不同时间后弃去培养液,MTT孵育后DMSO溶解,酶标仪测定比较不同阶段efaA~+、efaA~-菌的OD492值;4.共聚焦激光扫描显微镜观察比较efaA~+、efaA~-粪肠球菌所形成的生物膜:各菌株在玻片上形成生物膜,AO/EB染色后CLSM观察,比较efaA~+、efaA~-菌所形成生物膜的厚度及生物膜内层、中层、外层的细菌密度和活菌比例,并做统计学分析。5.采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR,检测efaA~+、efaA~-粪肠球菌在细菌培养皿内培养不同时间后所形成生物膜的efaA mRNA的表达,与生物膜的厚度变化进行对比。结果:1.肠球菌生物膜黏附期为2h,基本形成期为6h,成熟期为24h,播散期为48h。2.微量滴定板法比较生物膜形成能力,efaA~+粪肠球菌在各培养时间点的OD570均大于efaA~-菌,即efaA~+粪肠球菌的生物膜形成能力比efaA~-菌的强;3. MTT法比较生物膜不同阶段的活菌含量(OD492),efaA~+粪肠球菌在各培养时间点的OD492均大于efaA~-菌,即efaA~+粪肠球菌所形成的生物膜的活菌数比efaA~-菌的多;4.共聚焦激光显微镜观察,efaA~+粪肠球菌在不同阶段所形成的生物膜的厚度、细菌密度及活菌比例均比efaA~-菌的大;5. efaA~+粪肠球菌efaA mRNA的表达量随培养时间的延长而增加,24h时达最高水平,随后表达量降低,与生物膜平均厚度变化趋势相平行;efaA~-粪肠球菌未检测到efaA mRNA表达。