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棉花是世界上最重要的经济作物之一,在现代纺织工业中具有重要的经济地位。同时,棉花纤维是由胚珠表皮细胞发育而成的一种单细胞结构,因此成为研究植物细胞伸长和细胞壁生物合成的良好模型。本实验室通过对野生型陆地棉(Gossypium hirsutum)11.692个棉花纤维UniESTs芯片的转录组分析,鉴定得到了大量纤维伸长期特异性高表达的信号通路,其中脂肪酸合成和延伸途径相关酶类的表达高调显著,表明超长链脂肪酸生物合成或转运可能是纤维细胞伸长过程所必须的。
超长链脂肪酸(very-long chain fatty acids,VLCFAs)是指碳链长度超过18个碳原子的脂肪酸,在植物中是表皮蜡质、种子甘油酯、生物膜磷脂以及鞘脂的重要组成成分。超长链脂肪酸在细胞内行使重要功能,如构建和稳定细胞膜、蛋白运输、信号传递等。超长链脂肪酸的合成发生在质体内,由定位于内质网膜上的VLCFA合成酶复合体完成延伸反应。KCS作为超长链脂肪酸合成的第一步酶,对产物的形成起着重要作用。
KCS基因家族成员众多,具有严格的组织表达特异性和底物选择特异性。本文以陆地棉徐州-142为材料,通过序列比对和RACE反应,首次成功克隆得到了13个棉花KCS基因。多序列比对结果表明这13个基因的核苷酸序列同源性最高可达89％,其可编码蛋白序列的平均长度约为500个氨基酸,保守区集中在C末端。以N-J法构建的系统发生树将棉花KCS基因分为序列差异较大(核苷酸序列同源性为12％)的两个亚家族,一类是与已有研究报道的拟南芥AtFAE1序列相似的FAE-type亚家族;另一类是与酵母中执行脂肪酸延长功能的ELO合酶类似的ELO-type亚家族。
不同棉花组织中实时定量PCR(qRT-PCR)的结果显示,GhKCS8和GhKCS12的组织表达特异性明显,在快速伸长期纤维中的表达水平分别达到12个和7个GhUBQ7基因表达当量,其绝对表达丰度在所有快速伸长期纤维表达基因中可列前500强,是纤维组织中的优势表达基因。此外,GhKCS6、GhKCS13、GhKCS1、GhKCS10和GhKCS2也主要表达在10 DPA纤维组织中。这些在快速伸长期的棉花纤维中具有表达优势的基因很可能对细胞的快速生长有重要作用。
利用染色体步移技术,我们对纤维表达特异的基因进行其功能性启动子的克隆,以便进一步研究脂肪酸促进纤维发育机制,并可应用于转基因棉花的构建。目前已经得到GhKCS8,GhKCS12和GhKCS13三个基因比较完整的启动子区,分别为1101bp、1480bp和2299bp。其中GhKCS12和GhKCS13基因的启动子长度分别达到1480bp和2299bp,长度上基本符合完整功能性启动子的标准,理论上能够包含功能基因表达调控所必需的顺势作用元件。植物启动子在线分析软件PLACE的分析结果显示,三个启动子区内部有BR信号通路上重要转录因子BES1和BRZ1的潜在结合位点,推测超长链脂肪酸的合成可能受BR信号的调控。