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糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)已经成为一种越来越常见的疾病,发病率和致死率逐年升高,且发病者越来越趋于年轻化。随着糖尿病病情发展,会导致心脏,血管等多器官功能受损。遏制胰岛β细胞的损伤是治疗糖尿病的关键,因此减少某些病理原因(如炎症、应激)导致的胰岛细胞凋亡,对于预防糖尿病的发生发展至关重要。血管紧张素Ⅱ 1型受体自身抗体(angiotensin Ⅱ type1 receptor autoantibodies,AT1-AA)首先在先兆子痫患者血清中发现。本课题组前期研究已证实AT1-AA可以与胰岛β细胞上AT1R结合,促进胰岛β细胞凋亡,但具体机制不清。有研究报道,慢性炎症与2型糖尿病胰岛β细胞损伤有关,尤其炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)与2型糖尿病胰岛损伤关系更为密切。已有研究证实IL-1β活化的机制通路复杂,其中NLRP3炎性小体的激活对IL-1β的活化最为重要。激活的NLRP3炎性小体会促使Pro-IL-1β切割成熟,形成有活性的IL-1β而发挥作用。NLRP3炎性小体的激活可通过三条通路实现,包括活化氧(ROS),钾外流以及溶酶体破坏。硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)是一种内源性的硫氧还蛋白(thioredoxin,TRX)结合抑制蛋白,可以阻断TRX的抗自由基和抗凋亡功能而诱导细胞凋亡。已有研究证明AT1-AA具有促进炎症作用。那么,AT1-AA是否可以通过促进炎症发生进而促进胰岛β细胞损伤?因此本研究的主要目的是观察AT1-AA是否可以通过增加TXNIP表达,激活NLRP3炎性小体,导致IL-1β分泌增多,进而诱导胰岛β细胞损伤。目的:1.建立AT1-AA阳性大鼠模型,观察大鼠胰岛形态及功能以及TXNIP、NLRP3炎性小体、IL-1β变化。2.证实TXNIP-NLRP3-IL-1β信号通路在AT1-AA诱导的胰岛β细胞损伤中的作用。方法:1.AT1-AA阳性大鼠建模:用生物合成的AT1R-ECⅡ抗原肽段主动免疫实验组大鼠,用免疫佐剂与生理盐水制成的混合液免疫对照组大鼠。2.免疫组织化学染色法观察TXNIP、NLRP3炎性小体、IL-1β等蛋白的表达水平。3.CCK-8试剂盒检测细胞存活率。4.流式细胞术检测细胞凋亡水平。5.ELISA检测IL-1β分泌量。6.Western blot检测TXNIP、NLRP3、ASC、Caspase1、Cleaved Caspase3/Caspase3蛋白的表达水平7.Real time PCR检测TXNIP m RNA的表达水平。结果:1.成功建立AT1-AA主动免疫大鼠模型检测大鼠血清抗体滴度的结果显示,随着免疫时间延长,与对照组相比,免疫大鼠抗体滴度升高,在第4周时升高较明显(P<0.01),到第8周时,抗体滴度达高峰(P<0.01),模型建造成功(图1)。2.AT1-AA主动免疫大鼠胰岛组织结构和功能受损图2A结果显示,前4周免疫组大鼠体重与对照组大鼠体重无明显差异,第10周开始,免疫组大鼠体重开始降低,且在16周时体重出现明显降低(P<0.05)(图2A)。空腹血糖检测结果显示,从第8周开始到第16周,免疫组大鼠空腹血糖明显高于同期对照组(P<0.05)(图2B)。葡萄糖耐量试验结果显示,给予对照大鼠葡萄糖灌胃,2h后血糖值降至正常水平;12周及16周的免疫大鼠在灌胃2h后血糖值仍明显高于正常水平(P<0.05)(图2C)。胰岛素耐量试验结果显示,给予对照大鼠腹腔注射胰岛素,30min时血糖迅速下降,至2h时血糖恢复至正常水平;12周及16周的免疫大鼠注射胰岛素,30min大鼠血糖无明显变化(P<0.05)(图2D)。随着免疫时间延长,免疫组大鼠胰岛组织HE染色结果显示,胰岛组织结构紊乱严重(图2E)。以上结果提示,AT1-AA长期存在可以导致胰岛结构及功能受损。3.AT1-AA主动免疫大鼠胰岛细胞凋亡增加TUNEL染色结果显示,与对照组相比,随着免疫时间延长,免疫组大鼠胰岛组织细胞核变大,棕黄色颗粒增多(图3A)。Western blot结果显示,免疫大鼠胰岛组织Cleaved Caspase3/Caspase3比值相比于对照组明显升高(P<0.05)(图3B)。结果提示,AT1-AA长期存在可以导致胰岛组织凋亡增加。4.AT1-AA主动免疫大鼠血清中IL-1β分泌量增高免疫组织化学染色结果显示,与对照组相比,随着免疫时间延长,免疫大鼠胰岛组织中代表IL-1β的棕色颗粒增多,颜色加深(图4 A)。ELISA检测IL-1β分泌结果显示,随着免疫时间延长,免疫大鼠血清中IL-1β的分泌量不断增加(P<0.05)(图4B)。5.AT1-AA主动免疫大鼠胰岛组织NLRP3炎性小体激活免疫组化染色结果显示,与对照组相比,随着免疫时间延长,免疫组大鼠胰岛组织棕黄色颗粒增多(图5A)。Western blot结果显示,免疫组大鼠胰岛组织NLRP3、ASC、Caspase1 p10蛋白表达随着免疫时间的延长均逐渐升高(P<0.01)(图5B)。6.AT1-AA主动免疫大鼠胰岛组织TXNIP表达增高免疫组化染色结果显示,与对照组相比,免疫大鼠胰岛组织棕黄色颗粒增多,着色加深(图6A)。Western blot结果显示,免疫大鼠胰岛组织TXNIP蛋白表达水平随着免疫时间的延长不断增高(P<0.05)(图6B)。7.AT1-AA呈浓度及时间依赖性降低INS-1细胞的存活率CCK-8结果显示,与Negative-Ig G组相比,INS-1细胞存活率随AT1-AA浓度的增大而降低(P<0.05)(图7A)。与Negative-Ig G组相比,在AT1-AA作用24 h时细胞的存活率明显下降(P<0.01)(图7B)。8.AT1-AA明显增高INS-1细胞凋亡水平流式细胞技术结果显示,与Negative-Ig G组比较,AT1-AA实验组细胞凋亡率明显增加(P<0.01)(图8A)。Western blot结果显示,与Negative-Ig G对照组相比,AT1-AA实验组Cleaved Caspase3/Caspase3比值明显升高(P<0.01)(图8B)。9.AT1-AA可以促进INS-1细胞IL-1β的分泌ELISA实验结果显示,与Negative-Ig G组相比,AT1-AA可以使细胞IL-1β的分泌量明显增加(P<0.01)(图9)。10.NLRP3炎性小体-IL-1β参与了AT1-AA诱导的INS-1细胞凋亡Western blot结果显示,与Negative-Ig G对照组相比,AT1-AA组NLRP3炎性小体各蛋白表达水平均升高(P<0.05)(图10A)。使用NLRP3炎性小体的抑制剂MCC950孵育INS-1细胞,Western blot结果显示,与AT1-AA组相比,AT1-AA+MCC950组INS-1细胞Cleaved Caspase3/Caspase3比值下降(P<0.05)(图10B);IL-1β分泌量降低(P<0.05)(图10C)。11.TXNIP-NLRP3炎性小体-IL-1β参与了AT1-AA诱导INS-1细胞的凋亡采用Real-time PCR与Western blot检测TXNIP的表达量,与Negative-Ig G对照组相比,AT1-AA组TXNIP m RNA(P<0.01)和蛋白表达水平(P<0.01)均显著升高(图11A)。使用慢病毒包被的TXNIP sh RNA感染INS-1细胞,结果显示,与Scramble sh RNA组相比,TXNIP sh RNA组TXNIP m RNA(P<0.05)和蛋白表达(P<0.01)均显著下降(图11B),提示TXNIP干扰模型建立成功。与Scramble sh RNA组相比,Scramble sh RNA+AT1-AA组细胞凋亡率和Cleaved Caspase3/Caspase3比值明显增高(P<0.01);与Scramble sh RNA+AT1-AA组相比,TXNIP sh RNA+AT1-AA组细胞凋亡率和Cleaved Caspase3/Caspase3比值明显降低(P<0.01)(图11C),结果提示TXNIP参与了AT1-AA诱导的INS-1β细胞的凋亡。ELISA结果显示,与Scramble sh RNA组相比,Scramble sh RNA+AT1-AA组IL-1β分泌量明显增高(P<0.05);与Scramble sh RNA+AT1-AA组相比,TXNIP sh RNA+AT1-AA组IL-1β分泌量显著下降(P<0.05)(图11D)。Western blot结果显示,与Scramble sh RNA组相比,Scramble sh RNA+AT1-AA组NLRP3炎性小体各蛋白表达明显增高(P<0.05);与Scramble sh RNA+AT1-AA组相比,TXNIP sh RNA+AT1-AA组NLRP3炎性小体各蛋白表达均下降(P<0.05)(图11E)。以上结果提示TXNIP参与了NLRP3炎性小体的激活以及IL-1β水平的升高。12.替米沙坦(telmisartan,TM)可通过抑制TXNIP-NLRP3炎性小体-IL-1β减轻AT1-AA诱导INS-1细胞凋亡Western blot结果显示,与AT1-AA组相比,AT1-AA+TM组Cleaved Caspase3/Caspase3比值降低(P<0.05)(图12A);IL-1β分泌量减少(P<0.05)(图12B);NLRP3炎性小体的蛋白表达水平降低(P<0.05)(图12C);TXNIP蛋白表达也降低(P<0.05)(图12D)。结论:1.AT1-AA长期存在可导致大鼠胰岛结构受损、功能紊乱,同时可促进胰岛组织TXNIP、NLRP3炎性小体以及IL-1β水平升高;2.TXNIP-NLRP3-IL-1β通路参与了AT1-AA诱导的胰岛β细胞损伤;3.ARB通过抑制TXNIP-NLRP3-IL-1β通路改善AT1-AA诱导的胰岛β细胞损伤。