灰葡萄孢菌激活蛋白的纯化与功能研究

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激活蛋白是一类激活植物免疫系统、提高植物诱导抗性和促进植物生长的一类耐温蛋白质。本文从番茄灰葡萄孢(Botrytis cinerea)中分离纯化出一种能引起烟草过敏性反应的激活蛋白、该蛋白能诱导烟草和番茄抗病性、并能显著促进玉米植株生长;提高抗病相关酶活性活力。同时,为了蛋白生物农药的使用和生产、研究了灰葡萄孢菌高产蛋白的发酵培养基和发酵条件、测定了灰葡萄孢菌激活蛋白的生物活性。主要研究结果如下:  (1)通过菌丝超声破碎、高温处理(100℃30 min)、AKTA蛋白纯化仪和变性电泳割胶纯化等方法、从灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)的菌丝中分离纯化出一种激活蛋白、经SDS-PAGE电泳检测为单一条带和单一斑点、相对分子量为15 kD。  (2)该激活蛋白是一种可以诱导烟草产生过敏性反应的蛋白激发子、通过提高番茄抗性相关酶活性来诱导番茄对灰霉病的抗性、蛋白处理浓度为10μg/mL诱导能力最强、并且持效期最长。激活蛋白处理浓度为10μg/mL时也可以促进小麦苗的生长和根长。  (3)经MALDI ToF/ToF检测得到激活蛋白的氨基酸序列、该蛋白含有136个氨基酸、理论分子量为15.367 KD、其pI值为11.15。在NCBI数据库中protein Blast比对、与灰葡萄孢菌菌株Botryotinia fukeliana(strain BcDW1)或者Botryotinia fukeliana(strain T4)的一种假想蛋白一致。  (4)进行了碳源氮源正交试验设计、筛选了碳源、氮源和碳氮比、优化了培养温度、培养液初始pH值、转速和装液量等培养条件。获得最适培养成分为:蔗糖3%、酵母浸粉1%、0.1%硝酸钾、0.1%磷酸二氢钾、0.05%磷酸镁。最佳培养条件为:初始pH5.0-6.0之间、培养温度22℃、500 mL的三角瓶装液量为150 mL、摇床转速160 r/min。  (5)测定了灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)激活蛋白的生物活性。发酵破碎液可以提高烟草对TMV的抗性和促进玉米苗生长、稀释100倍时抗病效果(枯斑抑制率)超过45%、稀释1000倍对玉米苗的促进生长效果最好。
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